Проект Методические указания по селекции дрожжей винодельческого производства – скачать книгу бесплатно Скачать книгу

Поиск книг на сайте  |  Каталог книг в формате pdf, djvu, fb2  |  Читайте нас вЧитайте нас в twitter!
Не нашли нужную книгу? Закажите
Подпишитесь на бесплатную рассылку новых книг

Скачать книгу Проект Методические указания по селекции дрожжей винодельческого производства

Проект Методические указания по селекции дрожжей винодельческого производства

Проект Методические указания по селекции дрожжей винодельческого производства.

Проект

М Е Т О Д И Ч Е С К И Е   У К А З А Н И Я
ПО
СЕЛЕКЦИИ ДРОЖЖЕЙ ВИНОДЕЛЬЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

Разработано:

НИВиВ «Магарач», УААН Директор, академик УААН, д.с.-х.н., профессор

А.М. Авидзба

Ялта, 2008 г.

СОДЕРЖАНИЕ

2

стр
1 Область применения 4
2 Методы исследования физиолого-технологических
свойств рас дрожжей 5
2.1 Отбор производственных проб 5
2.2 Микроскопический анализ отобранных проб 6
2.3 Выделение чистых культур дрожжей из отдельных колонии 6
2.4 Характеристика выделенных штаммов дрожжей 8
2.4.1 Определение формы и величины клеток дрожжей 8
2.4.2 Определение систематического положения дрожжей 8
2.4.3 Определение фенотипа рас дрожжей 11
2.5 Подсчет общего количества клеток дрожжей
в счетных камерах 12
2.6 Определение физиологического состояния
клеток дрожжей 14
2.6.1 Подсчет живых клеток методом посева 14
2.6.2 Метод прижизненного окрашивания 15
2.7 Характеристика осадка 16
3 Технологические особенности рас дрожжей 16
3.1 Бродильная способность 16
3.2 Спиртообразующая способность 17
3.3 Спиртовыносливость 18
3.4 Устойчивость к диоксиду серы 18
3.4.1 Определение сульфитостойкости по скорости
забраживания 18
3.4.2 Определение сульфитостойкости по скорости размножения рас дрожжей в чашках Петри с сульфитированной
питательной средой 19
3.5 Кислотовыносливость 20

3

3.6 Холодо- и термостойкость 20
3.7 Способность образовывать летучие кислоты 21
3.8 Определение склонности культур к образованию
сероводорода 21
4 Определение посторонней микрофлоры 22
4.1 Элективные питательные среды 22
4.2 Дифференциально-диагностические среды 23
4.2.1 Определение бактерий 23
4.2.2 Определение дрожжей-бреттаномицетов 23
4.3 Питательные среды для культивирования дрожжей 25
4.3.1 Натуральные питательные среды 25
4.3.2 Синтетические среды 27
5 Список литературы 29

4

1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящая методика микробиологического анализа предназначена для установления морфолого-культуральных и физиолого-технологических показателей рас дрожжей и может быть использована для характеристики дрожжей, применяемых при получении столовых и шампанских виноматериалов.
Методика состоит из ряда методов, рекомендуемых для изучения морфолого-культуральных и физиолого-технологических свойств рас дрожжей в соответствии с разработанным «Качественным удостоверением на чистые культуры винных дрожжей».

Качественное удостоверение на чистые культуры винных дрожжей

(сертификат)

1.Название культуры

2.Вид

3.Фенотип

4.Коллекционный номер

5.Назначение культуры

6.Морфологические свойства

7.Технологические свойства

8.Особые отметки

9.Условия содержания

10.Гарантийный срок

хранения в условиях стерильности

5

2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОЛОГО-

КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И ФИЗИОЛОГО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РАС ДРОЖЖЕЙ

2.1 Отбор производственных проб

Все пробы, предназначенные для микробиологического исследования методом посева, следует отбирать при строгом соблюдении стерильности, исключить возможность загрязнения извне.
Перед отбором пробы следует тщательно продезинфицировать руки спиртом. Пробы отбирают стерильной пипеткой или стерильной стеклянной трубкой с оттянутым концом. Пробоотборник стерилизуется спиртом. Перед использованием промывается стерильной водой.
Часто при микробиологическом контроле игристых вин и виноматериалов пробу отбирают через краны, имеющиеся в резервуарах и коммуникациях. В этом случае тщательно промывают кран, а поверхность закрытого крана обрабатывают спиртом или обжигают пламенем спиртовки. Перед отбором пробы сливают от 2 до 10 дм3 вина, в зависимости от наличия застойных зон в месте отбора пробы.
Отбор проб производится в стерильную посуду. Непосредственно перед взятием образца колбу освобождают от пробки, обжигают горловину, наполняют вином и перед тем, как закрыть, снова обжигают горловину. В колбу наливают вино не более чем на одну треть объема с тем, чтобы при случайной встряске не смачивалась ватная пробка. Кроме того, непосредственно перед анализом: ценрифугированием, микрокопированием или посевом, пробу необходимо тщательно перемешать, если только она не отбиралась для анализа осадка.
Микробиологический анализ необходимо проводить непосредственно после взятия проб, но не позднее, чем через 2 часа при условии хранения образцов при температуре 6±1°С.

6

При контроле количественного состава микроорганизмов анализ проводят не позднее, чем через 20 мин. после взятия пробы.
При необходимости перевозки проб срок хранения увеличивается до трех дней при обязательном сохранении герметичности и стерильности (перевозки с ватными пробками не допускаются).
Если виноматериал долгое время оставался в состоянии покоя, пробы необходимо отбирать из различных слоев, в том числе и из осадка.
Правила отбора проб предусмотрены ГОСТ 14137-74 «Вина, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты. Правила приемки и методы отбора проб».

2.2. Микроскопический анализ отобранных проб

Отобранную пробу микроскопируют, определяют ориентировочно систематические группы дрожжей, наличие посторонней микрофлоры и описывают размер и стадии физиологического состояния клеток дрожжей: размножение - большое количество почкующихся клеток с однородной цитоплазмой и тонкой оболочкой; почкующейся клеткой считается та, у которой дочерняя клетка значительно меньше материнской;
брожение - культура в виде отдельных клеток; цитоплазма зернистая, мелкие вакуоли, имеется запас питательных веществ; отмирание – отставание цитоплазмы от клеточной стенки; мертвые клетки с непрозрачной цитоплазмой, иногда деформированные; большой процент мертвых клеток; автолизированные клетки - оболочка утолщенная, цитоплазма отходит от оболочки, клетки прозрачные;

покоящиеся клетки - имеют плотную оболочку, содержат жировые капли.

2.3. Выделение чистых культур дрожжей из отдельных колоний
Метод основан на выделении чистой культуры дрожжей из колонии, выросшей изолировано на плотной питательной среде. Для этого используют чашки Петри с плотной питательной средой. Заранее, за 2-3 суток, разливают стерильно в чашки Петри питательную среду (виноградный сусло-агар, тиражный виноматериал-агар с сахаром) слоем 5-6 мм.

7

Чтобы получить рост отдельных колоний на поверхности агара при выделении культур из бродящего виноградного сусла, нужно сделать его разведение. Для этого только что прокаленную и остуженную иглу погружают примерно на 1 см в бродящее сусло и сразу переносят в 0,5 см3 стерильной водопроводной воды в пробирке. После перемешивания содержимого пробирки из нее берут одну петлю посевного материала и переносят его на поверхность агара в чашку Петри. Маленькую каплю исследуемого материала размазывают легкими движениями стерильного стеклянного шпателя по поверхности агара.
Если чистую культуру дрожжей выделяют из виноматериала или других проб, содержащих неизвестное количество живых клеток дрожжей, то делают обычно два посева. Первый – более густой- делают из первоначального материала без разведения, второй – после предварительного разведения небольшого количества (1-2 капли) первоначального материала в
5 см стерильной воды в пробирке. Из этого разведения и из первоначального материала берут стерильной пинеткой по 1 капле посевного материала и переносят на поверхность агара в чашки Петри, где его распределяют по поверхности агара шпателем.
Можно посевной материал распределить по поверхности агара для получения отдельных колоний не шпателем, а посевом при помощи петли (штрихом). Для этого нужно взять стерильной (прокаленной и остуженной) петлей каплю исследуемого материала и сделать штрих по всей поверхности чашки с агаром. Чашки с посевами перевернуть вверх дном и инкубировать
4-5 сут при температуре 26±1°С.
Для выделения чистой культуры дрожжей прокаленной и остуженной петлей или лучше иглой прикасаются к выросшей изолированной колонии и переносят небольшое количество образующих ее клеток в пробирку со стерильным виноградным суслом или сусло-агаром. Через 2-3 сут. размножится чистая культура.

8

Чашечным методом не всегда можно сразу получить колонии чистых культур, так как часть выросших колоний может образоваться не из одной клетки, а из нескольких, склеившихся между собой или из попавших на поверхность агара близко одна к другой и давших сначала изолированные колонии, но вскоре слившихся в одну смешанную. Поэтому необходимо провести повторный рассев выделенной из отдельной колонии культуры одним из выше описанных способов и снова отсеять культуру из изолированной колонии. Чистоту выделенной культуры проверяют как микроскопированием (однородность клеток), так и повторными рассевами в чашки Петри (однородность вырастающих колоний).

2.4. Характеристика выделенных штаммов дрожжей

2.4.1 Определение формы и величины клеток дрожжей
Форма и размер клеток измеряется при помощи окулярного микрометра –
круглого стеклышка с нанесенными на него делениями
(1 мм разделен на 10 делений). Окулярный микрометр вставляют стороной с делениями вверх в окуляр.
Для определения истинной величины клетки необходим поправочный коэффициент, который устанавливают с помощью объективного микрометра с делениями I мм на 100 частей (одно деление равно 10 мкм). Объективный микрометр помещают на столик микроскопа и определяют, сколько окулярных и объективных делений помещается на отрезках от окулярного нуля до ближайшего совпадения черточек.
При микроскопировании препарата с живыми микроорганизмами с тем же объективом и окуляром, при которых определяется поправочный коэффициент, измеряют длину и ширину клеток. Замеряют обычно несколько клеток, затем средний показатель умножают на поправочный коэффициент.
2.4.2 Определение систематического положения дрожжей
Современные систематики дрожжей находятся в процессе становления.

9

Среди специалистов бродильных производств распространены наиболее известные классификации В.И.Кудрявцева (1970) и Ж.Лоддер (1970). Поскольку классификация В.И.Кудрявцева помимо морфологических и физиологических признаков учитывает присутствие видов в определенных условиях обитания и их адаптивные приспособления, то для производства рекомендуется данная классификация с синонимами видов по Ж. Лоддер (см. табл. 2.1).
Таблица 2.1 – Диагностические показатели по классификации дрожжей
В.И.Кудрявцева (часто встречаемые виды дрожжей в виноделии)

Виды дрожжей рода

Saccharomyces

Сбраживание сахаров

Ж. Лоддер

(1970)

В.И. Кудрявцев

(1970)

глю-

коза

галак-

тоза

сахаро

за

рафи-

ноза

лактоза

мальто

за

декст-

рины

S.cerevisiae

S. vini

1

+

+

1/3

-

+

-

S.cerevisiae

S.cerevisiae

+

+

+

1/3

-

+

+

S.uvarum

S.uvarum

+

+

+

+

-

+

-

S.uvarum

S.carlsbergensis

+

+

+

+

-

+

+

S.chevalieri

S.chevalieri

+

-

+

1/3

-

-

-

S.bayanus

S.oviformis

+

-

+

1 / 3

-

+

+

-

S.italicus

S.chodati

+

+

-

-

-

+

+

-

Примечание: «+» – сбраживает; "-" – не сбраживает;

при расщеплении рафинозы на фруктозу и, встречающуюся в виноделии,
мелибиозу, сбраживает только фруктозу, т.е. «1/3» часть рафинозы.

Спорообразование. Форма спор, способ их образования и прорастания являются родовыми признаками дрожжей. Поэтому при определении систематического положения выделенных культур дрожжей их высевают на специальные среды для спорообразования.

Дрожжи рода Saccharomyces размножаются почкованием. Форма клеток эллипсовидная. В зависимости от расы, условий культивирования клетки могут быть более овальными, округлыми. В жидкой питательной среде спор не образуют, с наступлением неблагоприятных условий развития на плотной

10 среде при свободном доступе воздуха образуют от 1 до 4 шаровидных гладких спор.

Для получения спор используют прием выращивания дрожжей в течение 1-2 суток на полной питательной среде, а затем пересевают их на голодную среду с ацетатом.
Установление формы спор, способа их образования и прорастания ведут при повторном микроскопировании дрожжей в период между посевом культуры на питательную среду и началом спорообразования.
Внутри рода Saccharomyces по систематике В.И.Кудрявцева насчитывается 18 видов дрожжей. Виды, относящиеся к этому роду, мало различаются по морфологии клеток, но хорошо различаются по способности усваивать углеводы. Изучение усвоения различных сахаров используют для определения видовой принадлежности дрожжей. Применяют для этого дрожжевую воду с добавлением 2% одного из сахаров: глюкозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафинозы. Среду стерилизуют 3 дня подряд либо в кипятильнике Коха, либо в автоклаве при давлении 0,05 МПа в течение 20-30 минут. Опыты по брожению различных сахаров ставят в трубках Дунбара, в которые стерильно разливают приготовленную стерильную питательную среду с разными сахарами и засевают изучаемыми культурами дрожжей. После перемешивания содержимого трубок их ставят таким образом, чтобы закрытое колено было направлено вверх, а закрытое ватной пробкой было в наклонном положении. Трубки помещают в термостат, ежедневно просматривают, их содержимое перемешивают и отмечаю усвоение сахара по выделению углекислоты и скоплению ее в закрытом колене трубок.
Для определения способности сбраживать декстрины готовится
«декстриновое» сусло. Для этого солодовое сусло (15° по Баллингу) сбраживается заведомо известными винными дрожжами (S.vini), которые оставляют декстрины нетронутыми. Затем такое «декстриновое» сусло стерильно фильтруется через фильтр Зейтца, разливается в стерильные

11 трубки Дунбара и засевается опытными культурами. Содержимое трубок перемешивается при ежедневных регистрациях результатов.

2.4.3 Определение фенотипа рас дрожжей
Установлено, что все дрожжи-сахаромицеты принадлежат к одному из 3-
х фенотипов: убийца(киллер)( К), нейтральный (N) или чувствительный (S).
Техника определения фенотипов К, N, S состоит в следующем. В чашки Петри разливают 1,5% виноградный сусло-агар за 2-3 суток до использования, чтобы он слегка подсох и затем хорошо впитывал нанесенную на него дрожжевую суспензию. Для предотвращения гидролиза агара его 3% водный раствор стерилизует отдельно от виноградного сусла и смешивают при температуре 60-70°С в равных количествах. Для лучшей контрастности зон подавления роста чувствительных культур в расплавленную среду можно добавлять перед розливом в чашки Петри стерильный 0,5%-ный водный раствор метиленового синего в количестве 1 мл на 200 см3 среды.
Отдельную колонию штамма дрожжей, фенотип которого необходимо
определить, изолируют иглой с плотной питательной среды и примерно в равном соотношении переносят на внутреннюю стенку пробирки с 0,5 см стерильной водопроводной воды и уколом на чашку Петри с газоном культуры фенотипа S. На одну чашку можно нанести в определенной последовательности до 30 уколов исследуемых штаммов.
Стерильно готовят водные суспензии тех же колоний в пробирках с 0,5см водопроводной воды, и на других чашках Петри с виноградным сусло-агаром (без газона штамма фенотипа 8) делают петлей газоны исследуемых штаммов дрожжей диаметром около 1,5 см. На них в центр наносят уколом штамм фенотипа К (известный стандарт), предварительно выращенный на виноградном сусло-агаре. На одну чашку можно нанести газоны 10 исследуемых штаммов в той же последовательности, что и на газоны штамма фенотипа S. Через двое суток инкубации чашек Петри с посевами при температуре 26±1°С определяют фенотипы штаммов. Если вокруг колоний
12 образовались зоны на газоне чувствительного штамма, то штаммы идентифицируются как киллеры. Штаммы, на газонах которых киллер образует зоны, являются чувствительными, остальные – нейтральные.
В качестве тестеров (индикаторных культур) можно использовать расы Берегово 4-7 (киллер) и Кахури 7 (чувствительная), имеющиеся в коллекции культур Инационального института винограда и вина «Магарач».
Применение рас дрожжей определенных фенотипов (К, N, S) позволяет проконтролировать, в какой степени чистая культура, внесенная в нестерильное виноградное сусло или в виноматериал для тиража, овладевает средой. Для этого необходимо определить процентное содержание дрожжей фенотипов (К, N, S) в нестерильном тиражном виноматериале или в виноградном сусле.

2.5. Подсчет общего количества клеток дрожжей в счетных камерах

Для определения количества микроорганизмов в 1 см3 жидкости производят подсчет их под микроскопом в счетной камере (Тома-Цейса, Горяева, Бюркера или Предтеченского). Счетная камера имеет вид толстого предметного стекла, в центре которого находится стеклянная пластина с выгравированной на ней сеткой (или 2 сетки на разделенной пополам пластинке). Слева и справа от центральной пластинки находятся 2 другие стеклянные пластинки с уровнем на 0,1 мм выше.
После тщательного перемешивания исследуемой жидкости берут каплю сухой стеклянной палочкой или петлей, наносят на сетку камеры, покрывают шлифованным плоскопараллельным покровным стеклом и притирают его большими пальцами к боковым пластинкам камеры до появления так называемых Ньютоновых колец. Подсчет начинают через 3-5 мин. после заполнения камеры. Счетную камеру находят под малым увеличением (10x8), а подсчет клеток микроорганизмов ведут при таком увеличении, чтобы в поле зрения микроскопа помещался один большой квадрат. Подсчитывают все клетки микроорганизмов, находящихся внутри большого квадрата и на пограничных линиях, если клетки больше чем наполовину находятся в

13 данном квадрате. Пополам пересеченные пограничной линией клетки считают только на двух смежных сторонах квадрата, например на верхней и правой. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 30, в противном случае необходимо суспензию разбавить водой. Для разъединения скоплений клеток в исследуемую пробу вводят равное количество 10%-ной серной кислоты. Для достоверности результатов в одной пробе должно быть сосчитано не менее 600 клеток микроорганизмов.

Поскольку точность определения зависит от того, насколько плотно покровное стекло пришлифовано к поверхности камеры, процесс установки стекла лучше повторить несколько раз, например, четыре, подсчитывая каждый раз по 150 клеток. Это обеспечит большую точность, чем подсчет
600 клеток при однократной сборке камеры. При дифференцированном подсчете почкующихся, живых и мертвых клеток дрожжей к суспензии добавляют раствор метиленовой сини (1:10000).
Подсчитывая результаты, следует учитывать степень разведения исходного материала, а также разбавление при введении серной кислоты или метиленовой сини. Расчет числа микроорганизмов в 1 мл исследуемого субстрата, подсчитанных в любой камере, проводится по формуле:

Х=А х 50000В,

где: X – количество микроорганизмов в 1 мл;
А – сумма подсчитанных клеток в пяти больших квадратах
(может быть средней при многократной сборке камеры);
В – разведение исходной суспензии микроорганизмов;
50000 – коэффициент перевода объема пяти больших квадратов камеры к 1 мл.
Полученные данные выражают в млн. клеток/мл.
Если в лаборатории отсутствует счетная камера, то грубый подсчет можно сделать, просчитав 5 полей зрения в одном препарате. Общее количество микроорганизмов находится по формуле:

Х = 0,25 х Ах В

14

где: X – количество микроорганизмов в 1 мл образца , млн..
0,25 – коэффициент пересчета;
А – среднее количество клеток в одном поле зрения;
В – разбавление исходного образца.

2.6. Определение физиологического состояния клеток дрожжей

2.6.1 Подсчет живых клеток методом посева
Для определения небольшого количества живых клеток, которые нельзя подсчитать в счетной камере, и для более точного определения большого количества живых микроорганизмов в исследуемом материале пользуются методом посева и культивирования. Для этого делают посев исследуемого субстрата на плотную питательную среду в чашки Петри и подсчитывают количество выросших колоний.
При небольшом количестве живых микроорганизмов в анализируемой пробе делают посев без разведений, а при большом их количестве делают разведения с таким расчетом, чтобы на чашке вырастали отдельные колонии и можно было их подсчитать.
Для разведения готовят пробирки со стерильной водопроводной водой по
4,5 мл в каждой (разливают стерильной пипеткой в стерильные пробирки около пламени). Затем стерильной пипеткой берут 0,5 мл исследуемой жидкости и вносят в пробирку № 1 с 4,5 мл стерильной воды. Получают разведение в 10 раз (или 1-е). Другой стерильной пипеткой перемешивают содержимое пробирки № 1, отбирают из нее 0,5 мл и вносят в пробирку №2 с
4,5 мл стерильной воды – получают разведение в 100 раз (или 2-е). Таким же образом, каждый раз беря новые стерильные пипетки, делают разведения в
1000 раз (3-е), в 10000 (4-е) и т.д.
Для посева берут стерильные чашки Петри (с заранее разлитой плотной питательной средой, благоприятной для размножения исследуемых микроорганизмов), надписывают на дне чашек номер разведения, берут новую стерильную пипетку и в чашку с №4 вносят 0,1 мл из 4-го разведения;

15 этой же пипеткой берут 0,1 мл 3-го разведения и вносят в чашку №3, этой же пипеткой берут 0,1 мл из 2-го разведения и вносят в чашку №2 и т.д.

Для равномерного распределения клеток на всей поверхности агара посевной материал растирают стерильным шпателем, начиная с большего разведения. Чашки с посевом переворачивают вверх дном и помещают в термостат с температурой 26±1°С. Через 5-7 сут. подсчитывают выросшие колонии. Для подсчета лучшими разведениями следует считать те, которые дали на агаре от 50 до 200 колоний. При большем числе колоний дно чашки Петри расчерчивается чернилами или восковым карандашом на несколько одинаковых секторов, считают число колоний в 2-3 секторах и среднее число, найденное для одного сектора, умножают на количество секторов.
Для определения количества живых микроорганизмов в 1 см3
исследуемой жидкости умножают число сосчитанных колоний на разведение и на 10, так как для посева на чашке бралось 0,1 см3.
Например, на чашке выросло 120 колоний в 3-м разведении. Это означает, что в 1 см3 исходного субстрата было 120x100x10=1 200 000 живых клеток микроорганизмов (1,2 млн.клеток/мл.).
2.6.2 Метод прижизненного окрашивания
Предназначен для дифференциации живых и мертвых клеток дрожжей. На предметном стекле смешивают каплю исследуемой жидкости с каплей раствора красителя (метиленовый голубой, нейтральный красный). Готовят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют сразу после приготовления. Живые клетки не окрашиваются, а мертвые окрашиваются в цвет красителя.
Приготовление метиленового голубого. В 100см3 этилового спирта с
объемной долей 96% растворяют З грамма красителя. Через 2-3 дня из него готовят с дистиллированной водой разведения в отношении 1:10; 1:40; 1:300. Растворы нестойкие. Хранить в темном прохладном месте.

16

Приготовление нейтрального красного. Готовится разведением в дистиллированной воде красителя в соотношении от 1:10000 до 1:150000. Растворы нестойкие. Хранить в защищенном от света месте.

2.7. Характеристика осадка

Анализ дрожжевых осадков ведут путем рассева их на агаризованное вино с 2% сахара и выделения отдельных колоний дрожжей (10-20) в пробирки, пенициллиновые склянки с тиражным виноматериалом для наблюдения за формированием осадка при температуре 12±2°С. В течение 2-3 недель оценивают характер образуемых осадков. Проводится отбор тех колоний, которые наиболее полно удовлетворяют требованиям производства. Из отобранных колоний создается консорциум, характер осадка которого проверяется в производственных условиях.

3. ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАС ДРОЖЖЕЙ

У выделенных чистых культур винных дрожжей в первую очередь определяют бродильную способность и такие важные их особенности – устойчивость к диоксиду серы, способность к накоплению летучих кислот, способность к образованию сероводорода, устойчивость к низким или высоким температурам, устойчивость к этанолу и кислотности сусла и виноматериалов.

3.1. Бродильная способность

Это свойство характеризуется склонностью и полнотой сбраживания 18-
20% сахара в виноградном сусле и сахара – в тиражном купаже. Опыты по сбраживанию ставят в небольших склянках (100см'), закрытых пробками.
Для выхода углекислого газа и предотвращения испарения бродящего сусла в пробе делают отверстие и вставляют в него специальный бродильный затвор, а при его отсутствии – стеклянную трубку с верхним концом, оттянутым в капилляр, или стеклянную трубку с ватным тампоном, на верхний конец которой надевают резиновый клапан. Для изготовления клапанов берут резиновый шланг такого же диаметра, как стеклянная трубка,

17 разрезают на отрезки длинной 5 см, делают на каждом лезвием острой бритвы прорезь длиной около 1 см, надевают каждый на стеклянную трубку, а верхний конец закрывают стеклянной бусиной или коротким отрезком стеклянной палочки. Углекислота, выделяющаяся при брожении, будет выходить через прорезь в клапане.

В склянки наливают виноградное сусло на 2/3 их объема, закрывают ватными пробками и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром в течение 30 мин. Когда сусло остынет, в него вносят разводки испытуемых культур дрожжей в одинаковом количестве и одного возраста. Закрывают пробками с бродильными затворами, капиллярами или клапанами, взвешивают на технических весах и ставят в термостат при температуре 25-
28°С. Ежедневно взвешивают и но убыли в массе, которая соответствует количеству выделившейся углекислоты, судят о скорости сбраживания сахара в сусле разными расами дрожжей. Опыты с каждой культурой нужно ставить не менее, чем в двух повторностях. Конец брожения определяют но отсутствию изменения в весе склянок. По общему количеству выделившейся к концу брожения углекислоты ориентировочно можно судить о полноте сбраживания сахаров сусла. Строят кривые брожения.
Скорость брожения тиражированного виноматериала в бутылках зависит от избранной расы дрожжей, температуры помещения и содержания спирта. Практически вторичное брожение виноматериала останавливается при объемной доле спирта в нем 14±1%, поэтому рекомендуются виноматериалы с объемной долей спирта не выше 12%. Снижает скорость брожения наличие свободного SО2 более 5мг/дм3.
Энергия брожения дрожжей контролируется измерением давления С02 в
бутылке на 10 и 40-й день брожения (ГОСТ 12258) и определением остаточных сахаров в конце брожения (ГОСТ 13192).

18

3.2. Спиртообразующая способность

Чтобы отобрать сильные культуры, обладающие наибольшей спиртообразующей способностью, сбраживают сусло с содержанием сахаров
29-30%. Спиртообразующую способность определяют по максимальному количеству спирта, которое могут образовывать расы при сбраживании высокосахаристого сусла. По окончании брожения определяют содержание спирта (ГОСТ 13191).

3.3. Спиртовыносливость

Под спиртовыносливостью следует понимать способность рас дрожжей проявлять жизнедеятельность при высоких концентрациях спирта в среде.
Для определения спиртовыносливости рас дрожжей готовят разводки исследуемых рас на пастеризованном вине с объемной долей содержания спирта 10-12% и 2% глюкозы. Вино выдерживают при температуре 25±1°С. Через 5 сут. разводку каждой расы дрожжей вносят в количестве 1% в пастеризованное вино с объемной долей спирта 15% и 2% глюкозы. Вино выдерживают при температуре 25±1°С и отмечают, на какие сутки в нем размножились дрожжи и оно начало забраживать. Опыты удобно ставить в пенициллиновых склянках, закрытых резиновыми пробками. Наиболее спиртовыносливыми являются расы дрожжей, ранее других размножившиеся в вине с объемной долей спирта 15%, наименее спиртовыносливые в таком вине не размножаются.

3.4. Устойчивость к диоксиду серы

Для сравнительного изучения сульфитостойкости различных культур дрожжей их нужно подвергнуть действию одинаковой дозы свободной SО2.
3.4.1 Определение сульфитостойкости по скорости забраживания
Сбраживают виноградное сусло, содержащее 100 мг/дм3 свободной SО2 или тиражный виноматериал с 20 мг/дм3 свободной SО2 в момент внесения разводок изучаемых культур. Вначале проводят пробную
19 сульфитацию сусла (тиражного виноматериала) разными дозами SО2 и выбирают такую, при которой через час после внесения SО2 будет содержаться в сусле около 100 мг/дм, в виноматериале – 20 мг/дм3 свободной сернистой кислоты. Опытные сусло и виноматериал сульфитируют выбранной дозой SО2, перемешивают и оставляют на час. В стерильные склянки небольшого объема, размеченные до стерилизации по 20 см , вносят но 0,2 двухсуточных разводок исследуемых рас дрожжей. Опыты ставят в трех повторностях. Через час после сульфитации в опытные склянки наливают сульфитированное сусло и закрывают резиновыми пробками,
обработанными спиртом. Склянки с суслом выдерживают при температуре
25±2°С, с тиражным виноматериалом – 12±2°С. Ежедневно, в течение 15-25 дней опытные склянки просматривают и отбирают сульфитостойкие расы дрожжей по скорости размножения и забраживания.
3.4.2 Определение сульфитостойкости по скорости размножения рас дрожжей в чашках Петри с сульфитированной питательной средой
Виноградное сусло (тиражный виноматериал) перед розливом в чашки Петри смешивают с равным количеством 3%-ного водного агара. В связи с невозможностью определять содержание SО2 в сусло-агаре для подбора дозы сульфитации виноградное сусло в нескольких контрольных позициях смешивают с таким же количеством водопроводной воды (вместо 3%-ного водного агара). Разбавленное сусло в склянках сульфитируют несколькими дозами крепкого водного раствора SО2 для того, чтобы можно было выбрать дозу, при которой через час после внесения SО2 в сусле, а также в сусло-агаре будет содержаться около 100мг/дм свободной SО2. Содержание свободной сернистой кислоты определяют йодометрическим методом.
Опытные двухсуточные культуры уколом иглы наносят на поверхность сульфитированного сусло-агара в количестве 25 штаммов на чашку. Чашки Петри с посевом выдерживают при температуре 25±2°С и 12±2°С. Сульфитостойкие культуры вырастают раньше других. Повторный отбор ведут при SО2 свободной в среде 150 мг/дм3.

20

3.5. Кислотовыносливость

В годы, неблагоприятные для вызревания винограда, отдельные его партии могут поступать на переработку при величине рН сусла 2,5-2,9. Имеются наблюдения, что не все расы дрожжей могут полностью сбродить сахар в сусле с такой низкой кислотностью. Чтобы получить полностью выброженные высококислотные виноматериалы, рекомендуется применять кислотовыносливые расы дрожжей.
Для отбора кислотовыносливых культур необходимо определять их бродильную способность в сусле с величиной рН 2,6 и содержанием сахаров
18% при температуре 25-27°С. При отсутствии в лаборатории сусла с такими кондициями его можно получить подкислением 10%-ным раствором винной кислоты и разбавлением водой обычного сусла с более высокой концентрацией сахаров и меньшей кислотностью. Отбирают те расы дрожжей, которые начинают размножаться и сбраживают сусло быстрее и полнее других. В конце брожения необходимо определить остаточные сахара, чтобы убедиться в полном выбраживании их в сусле с рН 2,6 отобранной культурой.
Условия для опытов по определению кислотовыносливости рас дрожжей на тиражном виноматериале: рН 2,8±25, температура 12±2°С, объемная доля спирта в виноматериале 11-12%.

3.6. Холодо- и термостойкость

Брожение сусла при температурах ниже 10°С и выше 30°С часто заканчивается недобродом, т.е. неполным сбраживанием сахаров виноградного сусла. Недоброды дают некондиционный виноматериал, склонный к заболеваниям. Чтобы избежать этого, для сбраживания сусла при низких и высоких температурах целесообразно применять холодо- и термовыносливыс расы дрожжей.
Для отбора холодовыносливых культур изучают бродильную способность (скорость и полноту сбраживания 18-20% сахаров в

21 виноградном сусле) при температуре 7°С и отбирают те расы, которые начинают размножаться и сбраживают сусло быстрее и полнее других. Условия для опытов по определению холодовыносливости рас дрожжей на тиражном виноматериале: объемная доля спирта в виноматериале 11-12%, температура 12±2°С и 25±2°С.

Для отбора термовыносливых культур изучают бродильную способность при температуре 35°С и отбирают те расы дрожжей, которые начинают размножаться и сбраживают сусло быстрее и полнее других при этой температуре. Контроль за ходом брожения осуществляется определением остаточных количеств сахаров по ГОСТ 13192-73.

3.7 Способность образовывать летучие кислоты

Неблагоприятное влияние на ход вторичного брожения и на качество готового продукта оказывают летучие кислоты. Увеличенное их содержание в тиражных виноматериалах сверх нормы компрометирует вино, и оно не может быть в этом случае допущено до тиража.
Определение массовой концентрации летучих кислот проводится согласно ГОСТ 14253-73.

3.8 Определение склонности культур к образованию сероводорода

Оценку сероводородобразующей способности штаммов дрожжей проводят на сусле белого технического сорта винограда или на тиражной смеси. Виноградное сусло разливают по 10 см3 в пробирки, стерилизуют однократным кипячением в течение 30 мин. в кипятильнике Коха.
Питательную среду засевают исследуемыми культурами дрожжей по
1 петле 4-х суточной культуры дрожжей. После посева над средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной 5% раствором уксуснокислого свинца, зажав ее между пробкой и горлышком пробирки на
1,5 – 2,0 см над поверхностью среды. Пробку обворачивают пленкой, чтобы не улетучивался сероводород, и инкубируют культуры при комнатной

22 температуре в течение 15 суток. По величине почернения бумаги вследствие образования сульфита свинца оценивают выделение сероводорода.

4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСТОРОННЕЙ МИКРОФЛОРЫ

4.1 Элективные питательные среды

Элективные питательные среды применяют для определения жизнеспособных молочнокислых, уксуснокислых бактерий и других посторонних микроорганизмов. Эти среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы родственных микроорганизмов и менее пригодны или совсем не пригодны для развития других.
Во все описанные жидкие питательные среды, предназначенныедля высева молочнокислых бактерий из сусла и вина, перед посевом вводят этиловый спирт из расчета содержания в среде 14 % об. (0,95 мл спирита на
5 мл среды). При таком содержании спирта размножаются преимущественно молочнокислые бактерии.
В питательной среде, содержащей 20 ед./мл мономицина, при высеве пробы исследуемого вина развиваются уксуснокислые бактерии. В присутствии этого антибиотика молочнокислые бактерии не размножаются.
Для преимущественного развития дрожжей и подавления сопутствующих бактерий в среду рекомендуется вводить антибиотик неомицин в количестве
20 ед./мл среды или совместно пеницилин и стрептомицин (50-100 ед.
каждого на 1 мл среды).
Для подавления роста плесневых грибов, которые интенсивно растут на сусле и сусло-агаре, рекомендуется добавлять 4% об. спирта или 0,2% пропионовокислого натрия.
При необходимости получения изолированной культуры пленчатых дрожжей в среду добавляют йодуксусную кислоту в количестве 0,1 – 0,2%.

23

4.2 Дифференциально-диагностические среды

Дифференциально-диагностические среды позволяют быстро отличить одни виды микроорганизмов от других. Готовят их часто с введением специальных красителей – индикаторов.
4.2.1 Определение бактерий
Для предварительного ориентировочного определения уксуснокислых бактерий и дифференциации их от молочнокислых, делают рассев культуры на дрожжевую воду с добавлением в нее 5-10% глюкозы, 10% желатина или
1% агара и 1% углекислого цинка. Молочнокислые бактерии к вредному действию цинка очень чувствительны, тогда как уксуснокислые бактерии растут на этой среде хорошо.
Для раздельного определения уксуснокислых и молочнокислых бактерий служит жидкая или плотная питательная среда с рН 7, состоящая из дрожжевой воды с добавлением 10% дрожжевого автолизата и смешанного индикатора 1:1 (бромкрезол красный и бром крезол зеленый, 0,1%-ные растворы в смеси воды со спиртом). Молочнокислые бактерии образуют молочную и уксусную кислоты, в результате чего реакция среды становится кислой и цвет индикатора меняется от синего через желто-зеленый до желтого. При развитии уксуснокислых бактерий образуется аммиак, который подщелачивает среду и изменяет ее цвет с синего на фиолетовый.
4.2.2 Определение дрожжей – бреттаномицетов
Для выделения и предварительной диагностики спользуется дифференциально-диагностическая среда UPP (Difco) следующего состава:
(в г на 1 дм3 водопроводной воды)
Дрожжевой экстракт 5
Пептон 10
Сахароза 20
Мел (СаСО3) 5
Агар-агар 20

24

Вокруг колоний дрожжей- бреттаномицетов образуется зона лизиса за счет выделения ими уксусной кислоты и вступлении ее в химическую реакцию с мелом.

Использование ПЦР-анализа для идентификации дрожжей-

бреттаномицетов
Для проведения ПЦР-реакции необходимы компоненты:
1. ДНК-матрица – участок ДНК, который необходимо копировать
2. Две небольшие (18-20 пар нуклеотидов) молекулы ДНК, которые комплементарны концам необходимого фрагмента (олигонуклеотидные праймеры DB90F и DB384R, специфичные к гену 26 S РНК; OL 7 и OL 8 – специфичные к гену URA 3)
3. Фермент – температуроустойчивая ДНК-полимераза (Тag-полимераза) –
белок, который способствует созданию копий молекул ДНК
4. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T) – из которых создаются новые копии ДНК-фрагмента
5. Буферный раствор в котором осуществляется синтез ДНК
Для проведения ПЦР-анализа необходимо следующее оборудование:

Наименование

оборудования

Назначение оборудования

Амплификатор ДНК

многокан.типа Eppendorf

программируемый термостат для проведения

реакции амплификации ДНК

UV- трансиллюминатор

предназначен для визуализации нуклеиновых

кислот и белков в гелях

Миницентрифуга

«MiniSpeen FVL-2400N»

для проведения пробоподготовки выделения

ДНК

Магнитная мешалка

для перемешивания реагентов

Силовой блок типа

Power supply

для проведения электрофореза нуклеиновых

кислот в агарозных гелях

Бокс для гель

электрофореза

(250х150мм)

получение электрофореграммы выделенной

ДНК

25

Термостат

для поддержания определенных температур

при культивировании микроорганизмов

ПЦР бокс UVC/T-M

для анализа выделенной ДНК в стерильных

условиях

Весы лабораторные

электрические WPS

510/C/1

определение веса вещества

Параметры термоцикла ( амплификации ) следующие :
- денатурация при 940С в течении 5 мин;
- 30 циклов денатурация при 940С в течении 45 сек.;
- отжиги при 550С в течении 35 сек.;
- удлинение при 720С 1 мин.;
- окончательное удлинение при 720С 2 мин.
Продукты ПЦР-анализа подвергаются элекрофорезу в 1% агарозном геле в ТАЕ-буфере (рН=8,0) при напряжении 50-70V в течении 1,5-3,0 часа.
Гели окрашивают бромидом этидия, визуализируют в ультрафиолетовом свете и фотографируют. Размеры оценивают сравнением со стандартами длины ДНК (GeneRule 1 kb DNA Ladder, Fermentas; GeneRule
100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas).

4.3 Питательные среды для культивирования дрожжей

4.3.1 Натуральные питательные среды.
Виноградное сусло. Сусло помещают в колбу и нагревают до кипения в кипятильнике Коха, после охлаждения отфильтровывают от выпавших белковых веществ через бумажный складчатый фильтр и разливают в пробирки по 5 см3, стараясь не смочить горлышки, затем в пробирках пастеризуют(автоклав- текучий пар, 30 мин.; трехкратно- в аппарате Коха, через сустки-по 30 мин.).
Для приготовления плотной среды готовят раздельно 4%-ный водный раствор агара и виноградное сусло и стерилизуют их: водный агар (100 мл в колбе на 200) в автоклаве при 121°С 20 мин., виноградное сусло –текучим

26 паром в кипятильнике Коха один раз. Перед использованием плотной среды расплавленный водный агар смешивают с горячим (60-70°С) суслом в равных объемах над пламенем спиртовки. После перемешивания разливают в чашки Петри или в пробирки. Среда лучше уплотняется и не отстает от стекла при добавлении 10% желатина.

Солодовое сусло. Неохмеленное пивное сусло фильтруют через бумажный фильтр для удаления осадка белковых веществ. Содержание сухих веществ (в

% СВ) определяют сахарометром. Путем разведения водопроводной водой готовят сусло с содержанием сухих веществ 3-4% и 6 – 8%.
Дрожжевая вода. 70-100 г свежих прессованных или 7-10 г сухих дрожжей разбалтывают в 1дм3 водопроводной воды и кипятят 30 мин. После отстаивания на холоде в высоком цилиндре жидкость декантируют и фильтруют. К фильтрату добавляют 1дм воды, еще раз кипятят 30 мин. и вновь фильтруют. Для лучшего осветления жидкости можно прибавить до кипячения взбитый с водой яичный белок. В дрожжевую воду вносят необходимые вещества (углеводы, соли), доводят рН среды до 6,0 и стерилизуют.

Вино с сахаром. В белое сухое вино (тиражный виноматериал) добавляют 2-

8-10% глюкозы или сахарозы. После его растворения среду фильтруют и разливают по пробиркам и пастеризуют.

Дрожжевой автолизат. К 1 кг прессованных дрожжей прибавляют 1дм3

водопроводной воды, прокипяченной и охлажденной до 60°С, смешивают в гомогенизированную массу и ставят в термостат при температуре 49±1°С. Для предотвращения инфицирования к дрожжевой суспензии добавляют толуол (несколько капель до появления ясного его запаха). Дрожжевую массу помещают в сосуды с запасом пространства, учитывая расширение толуола, плотно закрывают. Во время перемешивания (1-2 раза в день) сосуд открывают. Через 48-72 часа автолиз дрожжей заканчивается, дрожжевая масса разжижается. Затем массу нагревают в автоклаве при давлении 0,02
МПа 30 мин., по остывании фильтруют до полной прозрачности (лучше через
27 бумажную мезгу на воронке Бюхнера). Прозрачный фильтрат содержит около 0,9% азота. Осадок разводят в 600 см3 воды и вновь фильтруют. Фильтраты объединяют. В смеси содержание общего азота становится равным 0,6 – 0,8%. При необходимости автолизат нейтрализуют до рН 6,8 –
7,0, разливают в пробирки или склянки и стерилизуют в автоклаве 15 мин.
при давлении 0,05 МПа.
Автолизат дрожжей особенно богат парааминобензойной кислотой, пантотеновой кислотой и пиридоксином. Его удобно добавлять как источник витаминов в небольшом количестве к синтетическим средам. Полученный автолизат разбавляют водой (1:10) с добавлением 1 –2% сахара.
Для приготовления автолизата можно использовать осадочные винные дрожжи. Для этого их освобождают от вина, несколько раз промывают холодной водой, которую после осаждения дрожжей декантируют. Из отмытых дрожжей готовят автолизат так же, как описано выше.
4.3.2 Синтетические среды
В эту группу питательных сред входят среды, имеющие определенный состав, т.е. их основные составные части известны.

Среда Ридер. В состав среды входят следующие соли (в г на 1

дм3 воды):
Сернокислый аммоний 3,0
Сернокислый магний 0,7
Азотнокислый кальций 0,4
Хлористый натрий 0,5
Фосфорнокислый калий однозамещенный 1,0
Фосфорнокислый калий двузамещенный 0,1
Начальная величина рН среды 6,6.
Из состава среды может быть исключен азотнокислый кальций, который не используется дрожжами. Для опытов по размножению в среду добавляется 2% сахара, для опытов по брожению – 5 – 10%.

28

Синтетическая среда Ридер должна содержать кристаллические витамины в следующих концентрациях (в мкг на 1 см3 ):
Инозит 5,0
Биотин 0,0001
Пантотеновая кислота 0,25
Тиамин 1,0
Пиридоксин 0,25
Никотиновая кислота 0,5
Вместо витаминов можно добавить 2 г/дм3 дрожжевого экстракта.
Полная питательная среда. В состав среды входят (в г на 1 дм3 воды):
Пептон 10,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Глюкоза 20,0
Агар 20,0
Стерилизуют в автоклаве 30 мин. при давлении 0,08 МПа.
Среда с ацетатом. В состав среды входят (в г на 1 дм3 воды):
Ацетат натрия 10,0
Хлорид калия 5,0
Агар 25,0
Стерилизуют в автоклаве 30 мин. при давлении 0,1 МПа.
Среда Городковой. В состав среды входят (в г на 1 дм3 воды):
Пептон 10,0
Поваренная соль 5,0
Глюкоза 2,5
Агар 20,0
Среду нейтрализуют питьевой содой до рН 7,3; кипятят, пока не
расплавится агар, фильтруют, разливают в пробирки.
Стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин. при давлении 0,1 МПа.

29

5 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бурьян Н.И., Тюрина Л.В. Микробиология виноделия. – М.: Пищевая промышленность, 1979.
2. Бурьян Н.И. Микробиология виноделия / Ялта, 1997.-431с.
3. Бурьян Н.И. Практическая микробиология виноделия / Симферополь:
Таврида,- 2003.-559с.
4. Загоруйко В.А., Ткачев И.Ф., Скорикова Т.К., Черноусова И.В., Гержикова В.Г., Жилякова Т.А., Ткаченко М.Г., Сибирный А.А., Ищук Е.П. Обнаружение и идентификация штаммов дрожжей рода Bret-
tanomyces.- Магарач. Виноградарство и виноделие, 2007.-№3.-с.20-23.
5. Инструкция по микробиологическому контролю производства «Советское шампанское». – М.: АгроНИИТЭИПП, 1987.
6. Инструкция по микробиологическому контролю винодельческого производства. ИК10-04-05-40-89. – М., 1990.
7. Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей. – М.: Издательство АН СССР, 1954.-8.-,
1970.
8. Квасников Е.И., Щелокова И.Ф. Дрожжи. Биология. Пуги использования. – Киев: Наукова думка, 1991.
9. Кишковская С.А., Разуваев В.С. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в винодельческой промышленности / Москва: Агропромиздат.-
1986.-144 с.
10. Национальная коллекция микроорганизмов виноделия. Каталог культур/
Ялта, 2007.-249 с.
11. Порядок отбора проб для микробиологических анализов.СТСЭВ 3013-81.
12. Подготовка проб для микробиологических анализов ГОСТ 26669-85 (СТ СЭВ 3014-81).
13. Промышленная микробиология / Под ред.Н.С. Егорова.- Москва:
Высшая школа, 1989.- 688 с.

30

14. Сборник технологических инструкций, правил, нормативных материалов по винодельческой промышленности. – М.: Агропромиздат, 1985.

15. Справочник для работников лабораторий винзаводов. Технохимический и микробиологический контроль. – М: Пищевая промышленность, 1979.

16. Lodder J. The yeasts. A taxonomic studi.- Amsterdam-London.-

1970.-658 p.

17. The Yeasts a taxonomic study. Third revised and enlarged

edition by N.J.W.Kreger-van-Rij. Amsterdam,1984.-p.562-576.

Читать фрагмент, купить и скачать в магазине электронных книг Купить  и  скачать  книгу Читать фрагмент, купить и скачать книгу fb2, epub, на андроид в магазине электронных книг ЛитРес

Читайте спиcок всех книг онлайн для бесплатного скачивания без регистрации: Рецепты домашних вин

Каталог книг по темам для бесплатного скачивания в электронных форматах

Наш сайт регулярно обновляется, и Вы можете получать новинки – электронные книги, которые на нём размещаются.
Подпишитесь на обзор книжек, и он будет приходить на Вашу электронную почту.
Вы всегда сможете легко отказаться от этой бесплатной рассылки. --> Читать последний выпуск книжной рассылки
подписаться на новые книги:
 
Я
Ищу
в возрасте от до

 
Следите за книжными новинками в Twitter
Рейтинг@Mail.ru Яндекс.Метрика +Freabooks