Проект Методичні вказівки по селекції дріжджів виноробного виробництва – скачать книгу бесплатно Скачать книгу

Поиск книг на сайте  |  Каталог книг в формате pdf, djvu, fb2  |  Читайте нас вЧитайте нас в twitter!
Не нашли нужную книгу? Закажите
Подпишитесь на бесплатную рассылку новых книг

Скачать книгу Проект Методичні вказівки по селекції дріжджів виноробного виробництва

Проект Методичні вказівки по селекції дріжджів виноробного виробництва

Проект Методичні вказівки по селекції дріжджів виноробного виробництва.

Проект

М Е Т О Д И ЧНІ   В К А З ІВКИ
ПО СЕЛЕКЦІЇ ДРІЖДЖІВ ВИНОРОБНОГО ВИРОБНИЦТВА

Науковий керівник проекту
Зав. відділом мікробіології,
д.т.н., професор С.А. Кишковська
Ялта – 2008 р.

ЗМІСТ

2

стр
1 Область застосування 4
2 Методи дослідження фізіолого-технологічних
властивостей рас дріжджів 5
2.1 Добір виробничих проб 5
2.2 Мікроскопічний аналіз відібраних проб 6
2.3 Виділення чистих культур дріжджів з окремі колонії 6
2.4 Характеристика виділених штамів дріжджів 8
2.4.1 Визначення форми й величини клітин дріжджів 8
2.4.2 Визначення систематичного положення дріжджів 8
2.4.3 Визначення фенотипу рас дріжджів 11
2.5 Підрахунок загальної кількості клітин дріжджів
у рахункових камерах 12
2.6 Визначення фізіологічного стану
клітин дріжджів 14
2.6.1 Підрахунок живих клітин методом посіву 14
2.6.2 Метод прижиттєвого фарбування 15
2.7 Характеристика осаду 16
3 Технологічні особливості рас дріжджів 16
3.1 Бродильна здатність 16
3.2 Спиртообразующая здатність 17
3.3 Спиртовыносливость 18
3.4 Стійкість до диоксиду сірки 18
3.4.1 Визначення сульфитостойкости по швидкості
забраживания 18
3.4.2 Визначення сульфитостойкости по швидкості розмноження рас дріжджів у чашках Петри із сульфітованою живильною
средой 19
3.5 Кислотовыносливость 20

3

3.6 Холодо- і термостійкість 20
3.7 Здатність утворювати летучі кислоти 21
3.8 Визначення схильності культур до утворення сірководню
21
4 Визначення сторонньої мікрофлори 22
4.1 Элективные живильні среды 22
4.2 Диференційно-діагностичні середовища 23
4.2.1 Визначення бактерій 23
4.2.2 Визначення дріжджів-бреттаномицетов 23
4.3 Живильні для середовища культивування дріжджів 25
4.3.1 Натуральні живильні среды 25
4.3.2 Синтетичні середовища 27
5 Список літератури 29

4

1 ОБЛАСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ

Справжня методика мікробіологічного аналізу призначена для встановлення морфолого-культуральных і фізіолого-технологічних показників рас дріжджів і може бути використана для характеристики дріжджів, застосовуваних при одержанні столових і шампанських виноматеріалів.
Методика складається з ряду методів, що рекомендуються для вивчення морфолого-культуральных і фізіолого-технологічних властивостей рас дріжджів відповідно до розробленого «Якісним посвідченням на чисті культури винних дріжджів».

Якісне посвідчення на чисті культури винних дріжджів

(сертифікат)

1.Назва культури

2.Вид

3.Фенотип

4.Колекційний номер

5.Призначення культури

6.Морфологічні властивості

7.Технологічні властивості

8.Особливі оцінки

9.Умови змісту

10.Гарантійний строк зберігання в умовах стерильності

5

2 МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ МОРФОЛОГО-КУЛЬТУРАЛЬНЫХ І ФІЗІОЛОГО-ТЕХНОЛОГІЧНИХ

ВЛАСТИВОСТЕЙ РАС ДРІЖДЖІВ

2.1 Добір виробничих проб

Всі проби, призначені для мікробіологічного дослідження методом посіву, варто відбирати при строгому дотриманні стерильності, виключити можливість забруднення ззовні.
Перед добором проби треба ретельно продезинфицировать руки спиртом. Проби відбирають стерильною піпеткою або стерильною скляною трубкою з відтягнутим кінцем. Пробоотборник стерилізується спиртом. Перед використанням промивається стерильною водою.
Часто при мікробіологічному контролі гристих вин і виноматеріалів пробу відбирають через крани, наявні в резервуарах і комунікаціях. У цьому випадку ретельно промивають кран, а поверхня закритого крана обробляють спиртом або обпалюють полум'ям спиртівки. Перед добором проби зливають від 2 до 10 дм3 вина, залежно від наявності застійних зон у місці добору проби.
Добір проб виробляється в стерильний посуд. Безпосередньо перед узяттям зразка колбу звільняють від пробки, обпалюють горловину, наповнюють вином і перед тим, як закрити, знову обпалюють горловину. У колбу наливають вино не більше ніж на одну третину обсягу для того, щоб при випадковому струсі не змочувалася ватяна пробка. Крім того, безпосередньо перед аналізом: ценрифугированием, мікрокопіюванням або посівом, пробу необхідно ретельно перемішати, якщо тільки вона не відбиралася для аналізу осаду.
Мікробіологічний аналіз необхідно проводити безпосередньо після узяття проб, але не пізніше, ніж через 2 години за умови зберігання зразків при температурі 6±1°С.
При контролі кількісного складу мікроорганізмів аналіз проводять не пізніше, ніж через 20 хв. після узяття проби.

6

При необхідності перевезення проб строк зберігання збільшується до трьох днів при обов'язковому збереженні герметичності й стерильності (перевезення з ватяними пробками не допускаються).
Якщо виноматеріал довгий час залишався в стані спокою, проби необхідно відбирати з різних шарів, у тому числі й з осаду.
Правила добору проб передбачені ДЕРЖСТАНДАРТ 14137-74 «Вина, виноматеріали, коньяки й коньячні спирти. Правила приймання й методи добору проб».

2.2 Мікроскопічний аналіз відібраних проб

Відібрану пробу мікроскопіюють, визначають орієнтовно систематичні групи дріжджів, наявність сторонньої мікрофлори й описують розмір і стадії фізіологічного стану клітин дріжджів:
розмноження - велика кількість клітин, що брунькуються, з однорідною цитоплазмою й тонкою оболонкою; клітиною, що брунькується, уважається та, у якої дочірня клітина значно менше материнської; шумування - культура у вигляді окремих клітин; цитоплазма зерниста, дрібні вакуолі, є запас живильних речовин; відмирання – відставання цитоплазми від клітинної стінки; мертві клітини з непрозорою цитоплазмою, іноді деформовані; великий відсоток мертвих клітин;

автолизированные клітини - оболонка стовщена, цитоплазма відходить від оболонки, клітини прозорі;

спочиваючі клітини - мають щільну оболонку, містять жирові краплі.

2.3. Виділення чистих культур дріжджів з окремих колоній
Метод заснований на виділенні чистої культури дріжджів з колонії, що виросла ізольована на щільному живильному середовищі. Для цього використовують чашки Петри із щільним живильним середовищем. Заздалегідь, за 2-3 доби, розливають стерильно в чашки Петри живильне ( середовищевиноградний сусло-агар, тиражний виноматеріал-агар із цукром) шаром 5-6 мм.

7

Щоб одержати ріст окремих колоній на поверхні агару при виділенні культур з виноградного сусла, що бродить, потрібно зробити його розведення. Для цього тільки що прожарену й охолоджену голку занурюють приблизно на 1 див у сусло, що бродить, і відразу переносять в 0,5 див3 стерильні водопровідні води в пробірці. Після перемішування вмісту пробірки з її беруть одну петлю посівного матеріалу й переносять його на поверхню агару в чашку Петри. Маленьку краплю досліджуваного матеріалу розмазують легкими рухами стерильного скляного шпателя по поверхні агару.
Якщо чисту культуру дріжджів виділяють із виноматеріалу або інших проб, що містять невідому кількість живих клітин дріжджів, то роблять звичайно два посіви. Перший – більше густий- роблять із первісного матеріалу без розведення, другий – після попереднього розведення невеликої кількості (1-2 краплі) первісного матеріалу в 5 див стерильної води в пробірці. Із цього розведення й з первісного матеріалу беруть стерильною пінеткою по 1 краплі посівного матеріалу й переносять на поверхню агару в чашки Петри, де його розподіляють по поверхні агару шпателем.
Можна посівний матеріал розподілити по поверхні агару для одержання окремих колоній не шпателем, а посівом за допомогою петлі (штрихом). Для цього потрібно взяти стерильної (прожареною й охолодженої) петлею краплю досліджуваного матеріалу й зробити штрих по всій поверхні чашки з агаром. Чашки з посівами перевернути нагору дном і инкубировать 4-5 сут при температурі 26±1°С.
Для виділення чистої культури дріжджів прожареною й охолодженою петлею або краще голкою доторкаються до вирослої ізольованої колонії й переносять невелика кількість утворюючих її клітин у пробірку зі стерильним виноградним суслом або сусло-агаром. Через 2-3 сут. розмножиться чиста культура.
Чашковим методом не завжди можна відразу одержати колонії чистих культур, тому що частина вирослих колоній може утворитися не з однієї

8 клітини, а з декількох, що склеїлися між собою або з, що потрапили на поверхню агару близько одна до іншої й давших спочатку ізольовані колонії, але незабаром злилися в одну змішану. Тому необхідно провести повторний розсів виділеної з окремої колонії культури одним з вище описаних способів і знову відсіяти культуру з ізольованої колонії. Чистоту виділеної культури перевіряють як микроскопированием (однорідність клітин), так і повторними рассевами в чашки Петри (однорідність колоній, що виростають).

2.4 Характеристика виділених штамів дріжджів

2.4.1 Визначення форми й величини клітин дріжджів
Форма й розмір клітин виміряється за допомогою окулярного мікрометра
- круглого скельця з нанесеними на нього розподілами
(1 мм розділений на 10 розподілів). Окулярний мікрометр вставляють стороною з розподілами нагору в окуляр.
Для визначення щирої величини клітини необхідний поправочний коефіцієнт, що встановлюють за допомогою об'єктивного мікрометра з розподілами I мм на 100 частин (один розподіл дорівнює 10 напівтемних). Об'єктивний мікрометр поміщають на столик мікроскопа й визначають, скільки окулярних і об'єктивних розподілів міститься на відрізках від окулярного нуля до найближчого збігу рисок.
При микроскопировании препарату з живими мікроорганізмами з тим же об'єктивом і окуляром, при яких визначається поправочний коефіцієнт, вимірюють довжину й ширину клітин. Замірять звичайно кілька клітин, потім середній показник множать на поправочний коефіцієнт.
2.4.2 Визначення систематичного положення дріжджів Сучасні систематики дріжджів перебувають у процесі становлення. Серед фахівців бродильних виробництв поширені найбільш відомі класифікації В.И.Кудрявцева (1970) і Ж.Лоддер (1970). Оскільки класифікація В.И.Кудрявцева крім морфологічних і фізіологічних ознак ураховує присутність видів у певних умовах перебування і їхні адаптивні

9 пристосування, то для виробництва рекомендується дана класифікація із синонімами видів по Ж. Лоддер (див. табл. 2.1).

Таблиця 2.1 – Діагностичні показники по класифікації дріжджів
В.И.Кудрявцева ( види, що зустрічаютьсячасто, дріжджів у виноробстві)

Види дріжджів роду

Saccharomyces

Сбраживание цукрів

Ж. Лоддер

(1970)

В.И. Кудрявцев

(1970)

глюкоз

а

галакто

за

сахаро

за

рафино

за

лактоза

мальто

за

декст-

рины

S.cerevisiae

S. vini

1

+

+

1/3

-

+

-

S.cerevisiae

S.cerevisiae

+

+

+

1/3

-

+

+

S.uvarum

S.uvarum

+

+

+

+

-

+

-

S.uvarum

S.carlsbergensis

+

+

+

+

-

+

+

S.chevalieri

S.chevalieri

+

-

+

1/3

-

-

-

S.bayanus

S.oviformis

+

-

+

1 / 3

-

+

+

-

S.italicus

S.chodati

+

+

-

-

-

+

+

-

Примітка: «+» – сбраживает; "-" – не сбраживает;

при розщепленні рафинозы на фруктозу й, що зустрічається у виноробстві,
мелибиозу, сбраживает тільки фруктозу, тобто «1/3» частина рафинозы.

Спорообразование. Форма спор, спосіб їхнього утворення й проростання є родовими ознаками дріжджів. Тому при визначенні систематичного положення виділених культур дріжджів їх висівають на спеціальні середовища для спорообразования.

Дріжджі роду Saccharomyces розмножуються брунькуванням. Форма клітин эллипсовидная. Залежно від раси, умов культивування клітини можуть бути більше овальними, округлими. У рідких живильних спор середовищі не утворять, з настанням несприятливих умов розвитку на щільному середовищі при вільному доступі повітря утворять від 1 до 4 кулястих гладких спор.
Для одержання спор використовують прийом вирощування дріжджів протягом 1-2 доби на повному живильному , середовищі а потім пересівають їх на голодне середовище з ацетатом.

10

Установлення форми суперечка, способу їхнього утворення й проростання ведуть при повторному микроскопировании дріжджів у період між посівом культури на живильне й з початком спорообразования.
Усередині роду Saccharomyces по систематиці В.И.Кудрявцева налічується 18 видів дріжджів. Види, що ставляться до цього роду, мало різняться по морфології клітин, але добре різняться по здатності засвоювати вуглеводи. Вивчення засвоєння різних цукрів використовують для визначення видової приналежності дріжджів. Застосовують для цього дріжджову воду з додаванням 2% одного із цукрів: глюкози, галактози, сахарози, мальтози, лактози, рафинозы. Середовище стерилізують 3 дні підряд або в кип'ятильнику Коха, або в автоклаві при тиску 0,05 Мпа протягом 20-30 хвилин. Досвіди по шумуванню різних цукрів ставлять у трубках Дунбара, у які стерильно розливають приготовлене стерильне живильне йз середовище різними цукрами й засівають досліджуваними культурами дріжджів. Після перемішування вмісту трубок їх ставлять таким чином, щоб закрите коліно було спрямовано нагору, а закрите ватяною пробкою було в похилому положенні. Трубки поміщають у термостат, щодня переглядають, їхній уміст перемішують і відзначаю засвоєння цукру по виділенню вуглекислоти й скупченню її в закритому коліні трубок.
Для визначення здатності сбраживать декстрини готується «декстринове» сусло. Для цього солодове сусло (15° по Баллингу) сбраживается свідомо відомими винними дріжджами (S.vini), які залишають декстрини недоторканими. Потім таке «декстринове» сусло стерильно фільтрується через фільтр Зейтца, розливається в стерильні трубки Дунбара й засівається досвідченими культурами. Уміст трубок перемішується при щоденних реєстраціях результатів.
2.4.3 Визначення фенотипу рас дріжджів
Установлено, що всі дріжджі-сахаромицеты належать до одному з 3-х фенотипів: убивця(киллер)( ДО), нейтральний (N) або чутливий (S).

11

Техніка визначення фенотипів ДО, N, S полягає в наступному. У чашки Петри розливають 1,5% виноградний сусло-агар за 2-3 доби до використання, щоб він злегка підсохнув і потім добре усмоктував нанесену на нього дріжджову суспензію. Для запобігання гідролізу агару його 3% водяний розчин стерилізує окремо від виноградного сусла й змішують при температурі 60-70°С у рівних кількостях. Для кращої контрастності зон придушення росту чутливих культур у розплавлене середовище можна додавати перед розливом у чашки Петри стерильний 0,5%-ный водяний розчин метиленового синього в кількості 1 мол на 200 див3 середовища.
Окрему колонію штаму дріжджів, фенотип якого необхідно визначити,
ізолюють голкою із щільного живильного й із приблизно в рівному співвідношенні переносять на внутрішню стінку пробірки з 0,5 див стерильної водопровідної води й уколом на чашку Петри з газоном культури фенотипу S. На одну чашку можна нанести в певній послідовності до 30 уколів досліджуваних штамів.
Стерильно готовлять водні суспензії тих же колоній у пробірках з 0,5див водопровідної води, і на інших чашках Петри з виноградним сусло-агаром (без газону штаму фенотипу 8) роблять петлею газони досліджуваних штамів дріжджів діаметром близько 1,5 див. На них у центр наносять уколом штам фенотипу ДО (відомий стандарт), попередньо вирощений на виноградному суслі-агарі. На одну чашку можна нанести газони 10 досліджуваних штамів у тій же послідовності, що й на газони штаму фенотипу S. Через двоє діб інкубації чашок Петри з посівами при температурі 26±1°С визначають фенотипи штамів. Якщо навколо колоній утворилися зони на газоні чутливого штаму, то штами ідентифікуються як киллеры. Штами, на газонах яких киллер утворить зони, є чутливими, інші – нейтральні.
Як тестери (індикаторних культур) можна використовувати раси Берегове
4-7 (киллер) і Кахури 7 (чутлива), наявні в колекції культур
Инационального інституту винограду й провина «Магарач».

12

Застосування рас дріжджів певних фенотипів (ДО, N, S) дозволяє проконтролювати, у якому ступені чиста культура, внесена в нестерильне виноградне сусло або у виноматеріал для тиражу, опановує середовищем. Для цього необхідно визначити процентний вміст дріжджів фенотипів (ДО, N, S) у нестерильному тиражному виноматеріалі або у виноградному суслі.

2.5. Підрахунок загальної кількості клітин дріжджів у рахункових камерах

Для визначення кількості мікроорганізмів в 1 див3 рідині роблять
підрахунок їх під мікроскопом у рахунковій камері ( Тому-Цейса, Горяева, Бюркера або Предтеченского). Рахункова камера має вигляд товстого предметного скла, у центрі якого перебуває скляна пластина з вигравіруваної на ній сіткою (або 2 сітки на розділеній навпіл пластинці). Ліворуч і праворуч від центральної пластинки перебувають 2 інші скляні пластинки з рівнем на
0,1 мм вище.
Після ретельного перемішування досліджуваної рідини беруть краплю сухою скляною паличкою або петлею, наносять на сітку камери, покривають шліфованим плоскопараллельным покривним склом і притирають його більшими пальцями до бічних пластинок камери до появи так званих Ньютоновых кілець. Підрахунок починають через 3-5 хв. після заповнення камери. Рахункову камеру знаходять під малим збільшенням (10x8), а підрахунок клітин мікроорганізмів ведуть при такому збільшенні, щоб у поле зору мікроскопа містився один великий квадрат. Підраховують всі клітини мікроорганізмів, що перебувають усередині великого квадрата й на прикордонних лініях, якщо клітини більше чим наполовину перебувають у даному квадраті. Навпіл пересічені прикордонною лінією клітини вважають тільки на двох суміжних сторонах квадрата, наприклад на верхній і правій. При підрахунку кількість клітин у великому квадраті не повинне перевищувати 30, у противному випадку необхідно суспензію розбавити водою. Для роз'єднання скупчень клітин у досліджувану пробу вводять рівна

13 кількість 10%-ний сірчаної кислоти. Для вірогідності результатів в одній пробі повинне бути полічене не менш 600 клітин мікроорганізмів.

Оскільки точність визначення залежить від того, наскільки щільно покривне скло пришлифовано до поверхні камери, процес установки скла краще повторити кілька разів, наприклад, чотири, підраховуючи щораз по
150 клітин. Це забезпечить більшу точність, чим підрахунок 600 клітин при однократному складанні камери. При диференційованому підрахунку що брунькуються, живих і мертвих клітин дріжджів до суспензії додають розчин метиленової сині (1:10000).
Підраховуючи результати, варто враховувати ступінь розведення вихідного матеріалу, а також розведення при введенні сірчаної кислоти або метиленової сині. Розрахунок числа мікроорганізмів в 1 мол досліджуваного субстрату, підрахованих у будь-якій камері, проводиться по формулі:

Х=А х 50000У,

де: X – кількість мікроорганізмів в 1 мол;
А – сума підрахованих клітин у п'яти більших квадратах
(може бути середньої при багаторазовому складанні камери);
У – розведення вихідної суспензії мікроорганізмів;
50000 – коефіцієнт перекладу обсягу п'яти більших квадратів камери до 1 мол.
Отримані дані виражають у млн. клітин/мол.
Якщо в лабораторії відсутня рахункова камера, то приблизний підрахунок можна зробити, прорахувавши 5 полів зору в одному препараті. Загальна кількість мікроорганізмів перебуває по формулі:

Х = 0,25 х Ах В

де: X – кількість мікроорганізмів в 1 мол зразка , млн..
0,25 – коефіцієнт перерахування;
А – середня кількість клітин в одному полі зору;
У – розведення вихідного зразка.

14

2.6. Визначення фізіологічного стану клітин дріжджів

2.6.1 Підрахунок живих клітин методом посіву
Для визначення невеликої кількості живих клітин, які не можна підрахувати в рахунковій камері, і для більше точного визначення великої кількості живих мікроорганізмів у досліджуваному матеріалі користуються методом посіву й культивування. Для цього роблять посів досліджуваного субстрату на щільне живильне в із чашки Петри й підраховують кількість вирослих колоній.
При невеликій кількості живих мікроорганізмів в аналізованій пробі роблять посів без розведень, а при великій їхній кількості роблять розведення з таким розрахунком, щоб на чашці виростали окремі колонії й можна було їх підрахувати.
Для розведення готовлять пробірки зі стерильною водопровідною водою по 4,5 мол у кожній (розливають стерильною піпеткою в стерильні пробірки біля полум'я). Потім стерильною піпеткою беруть 0,5 мол досліджуваної рідини й вносять у пробірку № 1 з 4,5 мол стерильноїої води. Одержують розведення в 10 разів (або 1-е). Іншою стерильною піпеткою перемішують уміст пробірки № 1, відбирають із її 0,5 мол і вносять у пробірку №2 з 4,5 мол стерильноїої води – одержують розведення в 100 разів (або 2-е). У такий же спосіб, щораз беручи нові стерильні піпетки, роблять розведення в 1000 разів ( 3-е), в 10000 ( 4-е) і т.д.
Для посіву беруть стерильні чашки Петри (із заздалегідь розлитим щільним живильним , середовищем сприятливої для розмноження досліджуваних мікроорганізмів), надписують на дні чашок номер розведення, беруть нову стерильну піпетку й у чашку з №4 вносять 0,1 мол з 4-го розведення; цією же піпеткою беруть 0,1 мол 3-го розведення й вносять у чашку №3, цією же піпеткою беруть 0,1 мол з 2-го розведення й вносять у чашку №2 і т.д.
Для рівномірного розподілу клітин на всій поверхні агару посівний матеріал розтирають стерильним шпателем, починаючи з більшого

15 розведення. Чашки з посівом перевертають нагору дном і поміщають у термостат з температурою 26±1°С. Через 5-7 сут. підраховують вирослі колонії. Для підрахунку кращими розведеннями варто вважати ті, які далечіні на агарі від 50 до 200 колоній. При більшому числі колоній дно чашки Петри розкреслюється чорнилом або восковим олівцем на кілька однакових секторів, уважають число колоній в 2-3 секторах і середнє число, знайдене для одного сектора, множать на кількість секторів.

Для визначення кількості живих мікроорганізмів в 1 див3 досліджуваній
рідині множать число полічених колоній на розведення й на 10, тому що для посіву на чашці бралося 0,1 див3.

Наприклад, на чашці виросло 120 колоній в 3-м розведенні. Це означає, що в

1 див3 вихідного субстрату було 120x100x10=1 200 000 живих клітин мікроорганізмів (1,2 млн.клітин/мол.).
2.6.2 Метод прижиттєвого фарбування
Призначений для диференціації живих і мертвих клітин дріжджів. На предметному склі змішують краплю досліджуваної рідини із краплею розчину барвника (метиленовий голубой, нейтральний червоний). Готовлять препарат «роздавлена крапля» і мікроскопіюють відразу після готування. Живі клітини не офарблюються, а мертві офарблюються у цвіт барвника.
Готування метиленового блакитного. В 100див3 етилового спирту з
об'ємною часткою 96% розчиняють Із грама барвника. Через 2-3 дня з нього готовлять із дистильованою водою розведення у відношенні 1:10; 1:40; 1:300. Розчини нестійкі. Зберігати в темному прохолодному місці.

Готування нейтрального червоного. Готується розведенням у дистильованій воді барвника в співвідношенні від 1:10000 до 1:150000. Розчини нестійкі. Зберігати в захищеному від світла місці.

2.7. Характеристика осаду

Аналіз дріжджових опадів ведуть шляхом розсіву їх на агаризованное вино з 2% цукри й виділення окремих колоній дріжджів (10-20) у пробірки, пенициллиновые склянки з тиражним виноматеріалом для спостереження за

16 формуванням осаду при температурі 12±2°С. Протягом 2-3 тижнів оцінюють характер утворених опадів. Проводиться добір тих колоній, які найбільше повно задовольняють вимогам виробництва. З відібраних колоній створюється консорціум, характер осаду якого перевіряється у виробничих умовах.

3. ТЕХНОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ РАС ДРІЖДЖІВ

У виділених чистих культур винних дріжджів у першу чергу визначають бродильну здатність і такі важливі їхні особливості – стійкість до диоксиду сірки, здатність до нагромадження летучих кислот, здатність до утворення сірководню, стійкість до низьких або високих температур, стійкість до этанолу й кислотності сусла й виноматеріалів.

3.1. Бродильна здатність

Ця властивість характеризується схильністю й повнотою сбраживания 18-
20% цукру у виноградному суслі й цукру – у тиражному купажі. Досвіди по сбраживанию ставлять у невеликих склянках (100див'), закритих пробками.
Для виходу вуглекислого газу й запобігання випару сусла, що бродить, у пробі роблять отвір і вставляють у нього спеціальний бродильний затвор, а при його відсутності – скляну трубку з верхнім кінцем, відтягнутим у капіляр, або скляну трубку з ватяним тампоном, на верхній кінець якої надягають гумовий клапан. Для виготовлення клапанів беруть гумовий шланг такого ж діаметра, як скляна трубка, розріжуть на відрізки довгої 5 див, роблять на кожному лезом гострої бритви проріз довжиною близько 1 див, надягають кожного на скляну трубку, а верхній кінець закривають скляною бусиною або коротким відрізком скляної палички. Вуглекислота, що виділяється при шумуванні, буде виходити через проріз у клапані.
У склянки наливають виноградне сусло на 2/3 їхнього обсягу, закривають ватяними пробками й стерилізують у кип'ятильнику Коха текучою парою протягом 30 хв. Коли сусло охолоне, у нього вносять розведення випробуваних культур дріжджів в однаковій кількості й одного віку.

17

Закривають пробками із бродильними затворами, капілярами або клапанами, зважують на технічних вагах і ставлять у термостат при температурі 25-28°С. Щодня зважують і але убули в масі, що відповідає кількості вуглекислоти, що виділилася, судять про швидкість сбраживания цукру в суслі різними расами дріжджів. Досвіди з кожною культурою потрібно ставити не менш, ніж у двох повторностях. Кінець шумування визначають але відсутності зміни у вазі склянок. По загальній кількості вуглекислоти, що виділилася до кінця шумування, орієнтовно можна судити про повноту сбраживания цукрів сусла. Будують криві шумування.
Швидкість шумування тиражованого виноматеріалу в пляшках залежить від вибраної раси дріжджів, температури приміщення й змісту спирту. Практично вторинне шумування виноматеріалу зупиняється при об'ємній частці спирту в ньому 14±1%, тому рекомендуються виноматеріали з об'ємною часткою спирту не вище 12%. Знижує швидкість шумування наявність вільного SО2 більше 5мг/дм3.
Енергія шумування дріжджів контролюється виміром тиску З02 у пляшці
на 10 і 40-й день шумування (ДЕРЖСТАНДАРТ 12258) і визначенням залишкових цукрів наприкінці шумування (ДЕРЖСТАНДАРТ 13192).

3.2. Спиртообразующая здатність

Щоб відібрати сильні культури, що володіють найбільшої спиртообразующей здатністю, сбраживают сусло зі змістом цукрів 29-30%. Спиртообразующую здатність визначають по максимальній кількості спирту, що можуть утворювати раси при сбраживании высокосахаристого сусла. По закінченні шумування визначають зміст спирта (ГОСТ 13191).

3.3. Спиртовыносливость

Під спиртовыносливостью варто розуміти здатність рас дріжджів проявляти життєдіяльність при високих концентраціях спирту в середовищі.

18

Для визначення спиртовыносливости рас дріжджів готовлять розведення досліджуваних рас на пастеризованому вині з об'ємною часткою змісту спирту 10-12% і 2% глюкози. Вино витримують при температурі 25±1°С. Через 5 сут. розведення кожної раси дріжджів вносять у кількості 1% у пастеризоване вино з об'ємною часткою спирту 15% і 2% глюкози. Вино витримують при температурі 25±1°С и відзначають, на яку добу в ньому розмножилися дріжджі й воно початок забраживать. Досвіди зручно ставити в пенициллиновых склянках, закритих гумовими пробками. Найбільше спиртовыносливыми є раси дріжджів, раніше інших размножившиеся в провині з об'ємною часткою спирту 15%, найменш спиртовыносливые в такому вині не розмножуються.

3.4. Стійкість до диоксиду сірки

Для порівняльного вивчення сульфитостойкости різних культур дріжджів їх потрібно піддати дії однакової дози вільної SО2.
3.4.1 Визначення сульфитостойкости по швидкості забраживания
Сбраживают виноградне сусло, що містить 100 мг/дм3 вільної SО2 або тиражний виноматеріал з 20 мг/дм3 вільної SО2 у момент внесення розведень досліджуваних культур. Спочатку проводять пробну сульфітацію сусла (тиражного виноматеріалу) різними дозами SО2 і вибирають таку, при
якій через годину після внесення SО2 буде втримуватися в суслі близько
100 мг/дм, у виноматеріалі – 20 мг/дм3 вільні сірчисті кислоти. Досвідчені сусло й виноматеріал сульфитируют обраною дозою SО2, перемішують і залишають на годину. У стерильні склянки невеликого обсягу, розмічені до стерилізації по 20 див , вносять але 0,2 дводобових розведень досліджуваних рас дріжджів. Досвіди ставлять у трьох повторностях. Через годину після сульфітації в досвідчені склянки наливають сульфітоване сусло й закривають гумовими пробками, обробленими спиртом. Склянки із суслом витримують при температурі 25±2°С, з тиражним виноматеріалом – 12±2°С. Щодня,

19 протягом 15-25 днів досвідчені склянки переглядають і відбирають сульфитостойкие раси дріжджів по швидкості розмноження й забраживания.

3.4.2 Визначення сульфитостойкости по швидкості розмноження рас дріжджів у чашках Петри із сульфітованою живильною средой
Виноградне сусло (тиражний виноматеріал) перед розливом у чашки Петри змішують із рівною кількістю 3%-ного водного агару. У зв'язку з неможливістю визначати зміст SО2 у сусло-агарі для підбора дози сульфітації виноградне сусло в декількох контрольних позиціях змішують із такою же кількістю водопровідної води (замість 3%-ного водного агару). Розведене сусло в склянках сульфитируют декількома дозами міцного водяного розчину SО2 для того, щоб можна було вибрати дозу, при якій через годину після внесення SО2 у суслі, а також у сусло-агарі буде втримуватися близько 100мг/дм вільної SО2. Зміст вільної сірчистої кислоти визначають йодометрическим методом.
Досвідчені дводобові культури уколом голки наносять на поверхню сульфітованого сусло-агару в кількості 25 штамів на чашку. Чашки Петри з посівом витримують при температурі 25±2°С и 12±2°С. Сульфитостойкие культури виростають раніше інших. Повторний добір ведуть при SО2 вільній у середовищі 150 мг/дм3.

3.5. Кислотовыносливость

У роки, несприятливі для визрівання винограду, окремі його партії можуть надходити на переробку при величині рн сусла 2,5-2,9. Є спостереження, що не всі раси дріжджів можуть повністю сбродить цукор у суслі з такою низькою кислотністю. Щоб одержати повністю выброженные высококислотные виноматеріали, рекомендується застосовувати кислотовыносливые раси дріжджів.
Для добору кислотовыносливых культур необхідно визначати їхню бродильну здатність у суслі з величиною рН 2,6 і змістом цукрів 18% при температурі 25-27°С. При відсутності в лабораторії сусла з такими кондиціями його можна одержати підкисленням 10%-ным розчином винної

20 кислоти й розведенням водою звичайного сусла з більше високою концентрацією цукрів і меншою кислотністю. Відбирають ті раси дріжджів, які починають розмножуватися й сбраживают сусло швидше й повніше інших. Наприкінці шумування необхідно визначити залишкові цукри, щоб переконатися в повному выбраживании їх у суслі із рн 2,6 відібраною культурою.

Умови для досвідів по визначенню кислотовыносливости рас дріжджів на тиражному виноматеріалі: рН 2,8±25, температура 12±2°С, об'ємна частка спирту у виноматеріалі 11-12%.

3.6. Холодо- і термостійкість

Шумування сусла при температурах нижче 10°С и вище 30°С часто закінчується недобродом, тобто неповним сбраживанием цукрів виноградного сусла. Недоброди дають некондиційний виноматеріал, схильний до захворювань. Щоб уникнути цього, для сбраживания сусла при низьких і високих температурах доцільно застосовувати холодо- і термовыносливыс раси дріжджів.
Для добору холодовыносливых культур вивчають бродильну здатність (швидкість і повноту сбраживания 18-20% цукрів у виноградному суслі) при температурі 7°С и відбирають ті раси, які починають розмножуватися й сбраживают сусло швидше й повніше інших. Умови для досвідів по визначенню холодовыносливости рас дріжджів на тиражному виноматеріалі: об'ємна частка спирту у виноматеріалі 11-12%, температура 12±2°С и
25±2°С.
Для добору термовыносливых культур вивчають бродильну здатність при температурі 35°С и відбирають ті раси дріжджів, які починають розмножуватися й сбраживают сусло швидше й повніше інших при цій температурі. Контроль за ходом шумування здійснюється визначенням залишкових кількостей цукрів за ДСТ 13192-73.

3.7 Здатність утворювати летучі кислоти

21

Несприятливий вплив на хід вторинного шумування й на якість готового продукту роблять летучі кислоти. Збільшений їхній зміст у тиражних виноматеріалах поверх норми компрометує вино, і воно не може бути в цьому випадку допущено до тиражу.
Визначення масової концентрації летучих кислот проводиться відповідно
ДО ДЕРЖСТАНДАРТУ 14253-73.

3.8 Визначення схильності культур до утворення сірководню

Оцінку сероводородобразующей здатності штамів дріжджів проводять на суслі білого технічного сорту винограду або на тиражній суміші. Виноградне сусло розливають по 10 див3 у пробірки, стерилізують однократним кип'ятінням протягом 30 хв. у кип'ятильнику Коха.
Живильне засівати середовище досліджуваними культурами дріжджів по 1 петлі 4-х добові культури дріжджів. Після посіву над середовищем поміщають смужку фільтрувального паперу, просоченої 5% розчином уксуснокислого свинцю, затисши її між пробкою й горлечком пробірки на 1,5
- 2,0 див над поверхнею середовища. Пробку обгортають плівкою, щоб не улетучивался сірководень, і инкубируют культури при кімнатній температурі протягом 15 доби. По величині почорніння паперу внаслідок утворення сульфіту свинцю оцінюють виділення сірководню.

4 ВИЗНАЧЕННЯ СТОРОННЬОЇ МІКРОФЛОРИ

4.1 Элективные живильні среды

Элективные живильні застосовувати середовища для визначення життєздатних молочнокислих, уксуснокислых бактерій і інших сторонніх мікроорганізмів. Ці середовища забезпечують переважний розвиток одного виду або групи родинних мікроорганізмів і менш придатні або зовсім не придатні для розвитку інших.
В усі описані рідкі живильні , середовища предназначенныедля висіву молочнокислих бактерій із сусла й вина, перед посівом уводять етиловий

22 спирт із розрахунку змісту в середовищі 14 % про. (0,95 мол спірита на 5 мол середовища). При такому змісті спирту розмножуються переважно молочнокислі бактерії.

У живильному , середовищі утримуючої 20 ед./мол мономицина, при висіві проби досліджуваного вина розвиваються уксуснокислые бактерії. У присутності цього антибіотика молочнокислі бактерії не розмножуються.
Для переважного розвитку дріжджів і придушення супутніх бактерій у середовище рекомендується вводити антибіотик неомицин у кількості 20 ед./мол середовища або спільно пеницилин і стрептоміцин (50-100 ед. кожного на 1 мол середовища).
Для придушення росту цвілевих грибів, які інтенсивно ростуть на суслі й сусло-агарі, рекомендується додавати 4% про. спирту або 0,2% пропионовокислого натрію.
При необхідності одержання ізольованої культури пленчатых дріжджів у середовище додають йодуксусную кислоту в кількості 0,1 – 0,2%.

4.2 Диференційно-діагностичні середовища

Диференційно-діагностичні середовища дозволяють швидко відрізнити одні види мікроорганізмів від інших. Готовлять їх часто із введенням спеціальних барвників – індикаторів.
4.2.1 Визначення бактерій
Для попереднього орієнтовного визначення уксуснокислых бактерій і диференціації їх від молочнокислих, роблять розсів культури на дріжджову воду з додаванням у неї 5-10% глюкози, 10% желатину або 1% агару й 1% вуглекислого цинку. Молочнокислі бактерії до шкідливої дії цинку дуже чутливі, тоді як уксуснокислые бактерії ростуть на цьому середовищі добре.
Для роздільного визначення уксуснокислых і молочнокислих бактерій служить рідке або щільне живильне йз середовище рн 7, що складається із

23 дріжджової води з додаванням 10% дріжджового автолизата й змішаного індикатора 1:1 (бромкрезол червоний і бром крезол зелений, 0,1%-ные розчини в суміші води зі спиртом). Молочнокислі бактерії утворять молочну й оцтову кислоти, у результаті чого реакція середовища стає кислої й цвіт індикатора міняється від синього через жовто-зелений до жовтого. При розвитку уксуснокислых бактерій утвориться аміак, що подщелачивает середовище й змінює її цвіт із синього на фіолетовий.

4.2.2 Визначення дріжджів – бреттаномицетов
Для виділення й попередньої діагностики спользуется диференційно-
діагностичне середовище UPP (Difco) наступного складу: (у г на 1 дм3 водопровідної води)
Дріжджовий екстракт 5
Пептон 10
Сахароза 20
Крейда (СаСО3) 5
Агар-агар 20
Навколо колоній дріжджів- бреттаномицетов утвориться зона лізису за рахунок виділення ними оцтової кислоти й вступі її в хімічну реакцію із крейдою.

Використання Пцр-Аналізу для ідентифікації дріжджів-

бреттаномицетов
Для проведення Пцр-Реакції необхідні компоненти:
1. Днк-матриця – ділянка ДНК, якому необхідно копіювати
2. Дві невеликі (18-20 пари нуклеотидов) молекули ДНК, які комплементарны кінцям необхідного фрагмента (олигонуклеотидные праймеры DB90F і DB384R, специфічні до гена 26 S РНК; OL 7 і OL 8 – специфічні до гена URA 3)
3. Фермент – температуроустойчивая Днк-полимераза ( Тag-Полимераза) –
білок, що сприяє створенню копій молекул ДНК
4. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T) – з яких створюються нові копії

24

Днк-фрагмента
5. Буферний розчин у якому здійснюється синтез ДНК
Для проведення Пцр-Аналізу необхідно наступне встаткування:

Найменування

встаткування

Призначення встаткування

Амплификатор ДНК

многокан.типу Eppendorf

програмувальний термостат для проведення

реакції ампліфікації ДНК

UV- трансиллюминатор

призначений для візуалізації нуклеиновых

кислот і білків у гелях

Миницентрифуга

«MiniSpeen FVL-2400N»

для проведення пробоподготовки виділення

ДНК

Магнітна мішалка

для перемішування реагентів

Силовий блок типу

Power supply

для проведення электрофореза нуклеиновых

кислот в агарозных гелях

Бокс для гель

электрофореза

(250х150мм)

одержання электрофореграммы виділеної ДНК

Термостат

для підтримки певних температур при

культивуванні мікроорганізмів

ПЦР бокс UVC/T-M

для аналізу виділеної ДНК у стерильних

умовах

Ваги лабораторні

електричні WPS 510/C/1

визначення ваги речовини

Параметри термоцикла ( ампліфікації ) наступні :
- денатурація при 940С у плині 5 хв;
- 30 циклів денатурація при 940С у плині 45 сек.;
- отжиги при 550С у плині 35 сек.;
- подовження при 720С 1 хв.;
- остаточне подовження при 720С 2 хв.
Продукти Пцр-Аналізу піддаються элекрофорезу в 1% агарозном гелі в
Тае-Буфері (рн=8,0) при напрузі 50-70V у плині 1,5-3,0 години.

25

Гелі офарблюють бромідом этидия, визуализируют в ультрафіолетовому світлі й фотографують. Розміри оцінюють порівнянням зі стандартами довжини ДНК (GeneRule 1 kb DNA Ladder, Fermentas; GeneRule
100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas).

4.3 Живильні для середовища культивування дріжджів

4.3.1 Натуральні живильні . середовища
Виноградне сусло. Сусло поміщають у колбу й нагрівають до кипіння в кип'ятильнику Коха, після охолодження отфильтровывают від білкових речовин, що випали, через паперовий складчастий фільтр і розливають у пробірки по 5 див3, намагаючись не змочити горлечка, потім у пробірках пастеризують(автоклав- текуча пара, 30 хв.; трикратно- в апарату Коха, через сустки-по 30 мін.).

Для готування щільного середовища готовлять роздільно 4%-ный водяний розчин агару й виноградне сусло й стерилізують їх: водний агар (100 мол у колбі на 200) в автоклаві при 121°С 20 хв., виноградне сусло –текучою парою в кип'ятильнику Коха один раз. Перед використанням щільного середовища розплавлений водний агар змішують із гарячим (60-70°С) суслом у рівних обсягах над полум'ям спиртівки. Після перемішування розливають у чашки Петри або в пробірки. Середовище краще ущільнюється й не відстає від скла при додаванні 10% желатину.

Солодове сусло. Неохмеленное пивне сусло фільтрують через паперовий фільтр для видалення осаду білкових речовин. Зміст сухих речовин (в % СВ) визначають сахарометром. Шляхом розведення водопровідною водою готовлять сусло зі змістом сухих речовин 3-4% і 6 – 8%.

Дріжджова вода. 70-100 г свіжих пресованих або 7-10 г сухих дріжджів розбовтують в 1дм3 водопровідної води й кип'ятять 30 хв. Після відстоювання на холоді у високому циліндрі рідина декантируют і фільтрують. До фільтрату додають 1дм води, ще раз кип'ятять 30 хв. і знову фільтрують. Для кращого посвітління рідини можна додати до кип'ятіння

26 збитий з водою яєчний білок. У дріжджову воду вносять необхідні речовини (вуглеводи, солі), доводять рн середовища до 6,0 і стерилізують.

Вино із цукром. У біле сухе вино (тиражний виноматеріал) додають 2-8-10% глюкози або сахарози. Після його розчинення середовище фільтрують і розливають по пробірках і пастеризують.

Дріжджовий автолизат. ДО 1 кг пресованих дріжджів додають 1дм3

водопровідної води, прокип'яченої й охолодженої до 60°С, змішують у датчанин масу й ставлять у термостат при температурі 49±1°С. Для запобігання інфікування до дріжджової суспензії додають толуол (трохи краплі до появи ясного його заходу). Дріжджову масу поміщають у судини із запасом простору, з огляду на розширення толуолу, щільно закривають. Під час перемішування (1-2 рази в день) судину відкривають. Через 48-72 години автоліз дріжджів закінчується, дріжджова маса розріджується. Потім масу нагрівають в автоклаві при тиску 0,02 МПа 30 хв., по остиганні фільтрують до повної прозорості (краще через паперову мезгу на лійці Бюхнера).
Прозорий фільтрат містить близько 0,9% азоту. Осад розводять в 600 див3
води й знову фільтрують. Фільтрати поєднують. У суміші зміст загального азоту стає рівним 0,6 – 0,8%. При необхідності автолизат нейтралізують до рн
6,8 –7,0, розливають у пробірки або склянки й стерилізують в автоклаві 15 хв.
при тиску 0,05 Мпа.
Автолизат дріжджів особливо багатий парааминобензойной кислотою, пантотеновой кислотою й пиридоксином. Його зручно додавати як джерело вітамінів у невеликій кількості до синтетичних середовищ. Отриманий автолизат розбавляють водою (1:10) з додаванням 1 –2% цукру.
Для готування автолизата можна використовувати осадові винні дріжджі. Для цього них звільняють від вина, кілька разів промивають холодною водою, що після осадження дріжджів декантируют. З відмитих дріжджів готовлять автолизат так само, як описано вище.
4.3.2 Синтетичні середовища

27

У цю групу живильних входити середовищ середовища, що мають певний склад, тобто їх основні складові частини відомі.

Середовище Ридер. До складу середовища входять наступні солі (у г на

1
дм3 води):
Сірчанокислий амоній 3,0
Сірчанокислий магній 0,7
Азотнокислий кальцій 0,4
Хлористий натрій 0,5
Фосфорнокислий калій однозаміщений 1,0
Фосфорнокислий калій двузамещенный 0,1
Початкова величина рн середовища 6,6.
Зі складу середовища може бути виключений азотнокислий кальцій, що не використовується дріжджами. Для досвідів по розмноженню в середовище додається 2% цукру, для досвідів по шумуванню – 5 – 10%.
Синтетичне середовище Ридер повинна містити кристалічні вітаміни в наступних концентраціях (у мкг на 1 див3 ):
Інозит 5,0
Біотин 0,0001
Пантотеновая кислота 0,25
Тіамін 1,0
Пиридоксин 0,25
Нікотинова кислота 0,5
Замість вітамінів можна додати 2 г/дм3 дріжджові екстракти.
Повне живильне . До складу середовища входять (у г на 1 дм3 води):
Пептон 10,0
Дріжджовий екстракт 5,0
Глюкоза 20,0
Агар 20,0
Стерилізують в автоклаві 30 хв. при тиску 0,08 Мпа.

28

Середовище з ацетатом. До складу середовища входять (у г на 1 дм3

води):
Ацетат натрію 10,0
Хлорид калію 5,0
Агар 25,0
Стерилізують в автоклаві 30 хв. при тиску 0,1 Мпа.

Середовище Городковой. До складу середовища входять (у г на 1 дм3

води):
Пептон 10,0
Поварена сіль 5,0
Глюкоза 2,5
Агар 20,0
Середовище нейтралізують питною содою до рн 7,3; кип'ятять, поки не
розплавиться агар, фільтрують, розливають у пробірки.
Стерилізують в автоклаві протягом 20 хв. при тиску 0,1 Мпа.

5 СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Бур'ян Н.И., Тюрина Л.В. Мікробіологія виноробства. – М.: Харчова промисловість, 1979.
2. Бур'ян Н.И. Мікробіологія виноробства / Ялта, 1997.-431с.
3. Бур'ян Н.И. Практична мікробіологія виноробства / Сімферополь:
Таврида,- 2003.-559с.
4. Загоруйко В.А., Ткачев И.Ф., Скорикова Т.К., Черноусова И.В., Гержикова В.Г., Жилякова Т.А., Ткаченко М.Г., Сибирный А.А., Ищук Е.П. Виявлення й ідентифікація штамів дріжджів роду Bret-tanomyces.- Магарач. Виноградарство й виноробство, 2007.-№3.-с.20-23.
5. Інструкція з мікробіологічного контролю виробництва «Радянське шампанське». – М.: Агрониитэипп, 1987.

29

6. Інструкція з мікробіологічного контролю виноробного виробництва.
ИК10-04-05-40-89. – М., 1990.
7. Кудрявцев В.И. Систематика дріжджів. – М.: Изд-В АН СССР, 1954.-8.-,
1970.
8. Квасників Е.И., Щелокова И.Ф. Дріжджі. Біологія. Пуги використання. – Київ: Наукова думка, 1991.
9. Кишковская С.А., Разуваев В.С. Основи мікробіології, санітарії й гігієни у виноробній промисловості / Москва: Агропромиздат.-1986.-144 с.
10. Національна колекція мікроорганізмів виноробства. Каталог культур/
Ялта, 2007.-249 с.
11. Порядок добору проб для мікробіологічних аналізів.СТСЭВ 3013-81.
12. Підготовка проб для мікробіологічних аналізів ДЕРЖСТАНДАРТ
26669-85
(СТ СЭВ 3014-81).
13. Промислова мікробіологія / Під ред.Н.С. Егорова.- Москва: Вища школа,

1989.- 688 с.

14. Збірник технологічних інструкцій, правил, нормативних матеріалів по виноробній промисловості. – М.: Агропромиздат,

1985.

15. Довідник для працівників лабораторій винзаводов. Технохимический і мікробіологічний контроль. – М: Харчова промисловість, 1979.

16. Lodder J. The yeasts. A taxonomic studi.- Amsterdam-London.-

1970.-658 p.

17. The Yeasts a taxonomic study. Third revised and enlarged

edition by N.J.W.Kreger-van-Rij. Amsterdam,1984.-p.562-576.

30

Виконавці:
Зав. відділом мікробіології
НІВіВ «Магарач» С.А. Кишковська
Провідний н.с. відділу мікробіології НІВіВ
«Магарач»
Н.І. Бур'ян
Ст.н.с. відділу мікробіології
НІВіВ «Магарач» Т.К. Скорікова
Ст.н.с. відділу мікробіології
НІВіВ «Магарач» О.В. Іванова
Ст.н.с. відділу мікробіології
НІВіВ «Магарач» Т.М. Танащук
Мл.н.с. відділу мікробіології НІВіВ
«Магарач»
Т.В. Чорноокова

Читать фрагмент, купить и скачать в магазине электронных книг Купить  и  скачать  книгу Читать фрагмент, купить и скачать книгу fb2, epub, на андроид в магазине электронных книг ЛитРес

Скачайте похожую бесплатную книгу:
Фитова Л. (ред.) Краткий технический справочник винодела

Читайте спиcок всех книг онлайн для бесплатного скачивания без регистрации: Рецепты домашних вин

Каталог книг по темам для бесплатного скачивания в электронных форматах

Наш сайт регулярно обновляется, и Вы можете получать новинки – электронные книги, которые на нём размещаются.
Подпишитесь на обзор книжек, и он будет приходить на Вашу электронную почту.
Вы всегда сможете легко отказаться от этой бесплатной рассылки. --> Читать последний выпуск книжной рассылки
подписаться на новые книги:
 
Я
Ищу
в возрасте от до

 
Следите за книжными новинками в Twitter
Рейтинг@Mail.ru Яндекс.Метрика +Freabooks