Інструкція з мікробіологічного контролю виробництва ігристих вин – скачать книгу бесплатно Скачать книгу

Поиск книг на сайте  |  Каталог книг в формате pdf, djvu, fb2  |  Читайте нас вЧитайте нас в twitter!
Не нашли нужную книгу? Закажите
Подпишитесь на бесплатную рассылку новых книг

Скачать книгу Інструкція з мікробіологічного контролю виробництва ігристих вин

Інструкція з мікробіологічного контролю виробництва ігристих вин

Інструкція з мікробіологічного контролю виробництва ігристих вин.

Українська Академія аграрних наук

Національний інститут винограду і вина «Магарач»

вул.. Кірова, 31, м.Ялта, АР Крим, Україна

Додаток Б

«ЗАТВЕРДЖУЮ» Директор НІВіВ «Магарач» академік УААН, д.с.-г.наук, проф.

Авідзба А.М.

« » 2008 р.

ІНСТРУКЦІЯ З МІКРОБІОЛОГІЧНОГО КОНТРОЛЮ ВИРОБНИЦТВА ІГРИСТИХ ВИН

КД……………………..

Розроблено:

Зам. директора по наукової роботи

НІВіВ «Магарач»,

чл.-кор. УААН, д.т.н., проф. В.О. Загоруйко

Науковий керівник проекту зав. відділом мікробіології

НІВіВ «Магарач», д.т.н., проф. С.А. Кишковська

Ялта-2008р.

КД……………………… 2

«ЗАТВЕРДЖУЮ»

Проект

Начальник відділу садівництва, виноградарства та виноробства МАПУ

М.Ф. Агафонов

« » 200 р.

ІНСТРУКЦІЯ З МІКРОБІОЛОГІЧНОГО КОНТРОЛЮ ВИРОБНИЦТВА ІГРИСТИХ ВИН

КД……………………..

Розроблено:

Директор НІВіВ «Магарач»

академік УААН, д.с.-г.наук, проф. А.М. Авідзба

Ялта-2008 р.

КД……………………… 3

ЗМІСТ

с.
1 Область застосування ...………………………………………………………… 3
2 Основні положення мікробіологічного контролю технологічного процесу шампанізації виноматеріалів, готових ігристих вин
і супутніх матеріалів ..…………………………………………………………… 4
2.1 Контроль виноматеріалів, що надходять на підприємства...……………………….......................................................................... 4
2.2 Мікробіологічний контроль виноматеріалів на витримці та
зберіганні, при складанні купажів і обезкислородження………………………… 6
2.3 Контроль готування розводки чистої культури...……………………………... 9
2.4 Мікробіологічний контроль готування лікерів (тиражного, резервуарного,
експедиційного) і допоміжних виноматеріалів…………………………………… 12
2.5 Мікробіологічний контроль шампанізації виноматеріалів…………………... 13
2.6 Контроль розливу гристих вин у пляшки……………………………………… 17
2.7 Контроль готової продукції……………………………………………………. 19
2.8 Контроль допоміжних матеріалів……………………………………………… 19
2.9 Контроль санітарного стану приміщень, технологічного
обладнання і резервуарів……………………………………………………………. 20
3 Основні методи дослідження і мікробіологічного аналізу...……...................... 20
3.1 Методи мікробіологічного контролю...………………………………….......... 20
3.2 Контроль процесу яблучно-молочного бродіння...………………………........ 26
3.3 Мікробіологічний контроль повітря...…………………………………............ 28
4 Загальні відомості про роботу в мікробіологічній лабораторії...……………. 29
4.1 Підготовка лабораторії...……………………………………………………….. 29
4.2 Готування живильних середовищ…………………………………………….. 32
4.3 Допоміжні пристрої та засоби контролю …………………………………… 34
5 Техніка безпеки...………………………………………………………………. 35
6 Перелік нормативно-технічної документації...………………………………. 36
Додаток А Стисла характеристика мікрофлори виноробного виробництва...………………………………………………………………………. 38
КД……………………… 4

КЕРІВНИЙ ДОКУМЕНТ

Інструкція з мікробіологічного КД

контролю виробництва ігристих вин Замість ІК 10-04-05-11-87

Дата введення

1 ОБЛАСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ

Дана інструкція призначена для мікробіологічного контролю процесу приготування ігристих вин.
Інструкція містить правила й методи мікробіологічного контролю чистої культури дріжджів, виноматеріалів, купажів, лікеру й допоміжних матеріалів, які використовуються при шампанізації вин і технології пляшкового, безперервного й періодичного (акратофорного) способів готування ігристих вин.
Інструкція передбачає використання спеціальних рас дріжджів з Національної колекції мікроорганізмів інституту винограду й вина «Магарач», щорічну перевірку виробничої культури дріжджів; а також, у випадку застосування препаратів активних сухих дріжджів – наявність заключення НІВіВ «Магарач» про відповідність їхньому сертифікату якості.
Інструкція є керівним документом для працівників заводських лабораторій.
Мікробіологічний контроль здійснює мікробіолог або особа, що виконує його обов'язки. Раса дріжджів, застосовувана у виробництві, повинна перевірятися відділом мікробіології Національного інституту винограду й вина «Магарач» не рідше одного разу в рік.
В інструкції даний докладний опис основних методів дослідження й мікробіологічного аналізу, що рекомендуються для роботи з контролю готування ігристих вин.
Систематичне проведення мікробіологічного контролю дозволяє стежити за нормальним розвитком чистих культур дріжджів і вчасно виявляти присутність сторонньої мікрофлори.
КД……………………… 5

2 ОСНОВНІ ПОЛОЖЕННЯ МІКРОБІОЛОГІЧНОГО КОНТРОЛЮ ТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРОЦЕСУ ШАМПАНІЗАЦІЇ ВИНОМАТЕРІАЛІВ, ГОТОВИХ ІГРИСТИХ ВИН І СУПУТНІХ МАТЕРІАЛІВ

Мікробіологічний контроль ведуть на всіх стадіях технології приготування вина з метою визначити мікробіальний стан контрольованих об'єктів, виявити вогнища інфекції і вчасно сформулювати рекомендації для усунення порушень нормального ходу технологічного процесу.
Мікробіологічний контроль ведуть по рубриках у відповідних таблицях, де зазначені гранично припустимі значення контрольованих параметрів, методи контролю, а також рекомендації контролю й контрольованих показників.
2.1 Контроль виноматеріалів, що надходять на підприємства
Проби виноматеріалів, які поступають на заводи ігристих вин відбирають за ГОСТ
14137-74 «Вино, виноматеріали, коньяки й коньячні спирти. Правила приймання й методи відбору проб» піддають органолептичній оцінці й мікроскопіюють.
2.1.1 Попередній, орієнтовно-експресний спосіб оцінки (табл.2.1) заснований на визначенні ступеню обсімененності виноматеріалів сумою мікроорганізмів у них: дріжджами, молочнокислими й оцетовокислими бактеріями. Загальне число клітин визначається прямим мікроскопіюванням відібраної проби або мікроскопіюванням після центрифуговання (п. 3.1).
При мікроскопуванні з попереднім центрифугованням 10 см3 досліджуваного матеріалу
центрифугують при частоті обертання 25 с-1 (1,5х103 об/хв) 10 хв або при частоті обертання
50 с-1 (3,0-5,0 х103 об/хв) 5 хвилин. Повністю зливають надосадову рідину й готовлять препарат для мікроскопування.
2.1.2 Для визначення кількості клітин мікроорганізмів в 1 см3 виноматеріалу роблять
орієнтовний підрахунок у п'яти полях зору мікроскопа або підрахунок у рахунковій камері
( п. 3.1 ). Орієнтовний підрахунок кількості клітин ведуть так. Підраховують кількість мікроорганізмів в 10 полях зору препарату «роздавлена крапля» (збільшення мікроскопа – окуляр х10 або х15, об'єктив х40), пересуваючи препарат по діагоналі. Потім обчислюють середню кількість клітин у п'яти полях зору. При необхідності визначення кількості клітин в
1 см3 розрахунок роблять по формулі, використованой при перерахуванні в рахунковій
камері.
Визначення систематичних груп мікроорганізмів проводять по морфологічній ознаці при мікроскопуванні. (Додаток А)
КД……………………… 6
Таблиця 2.1 – Експрес-оцінка мікробіологічного стану виноматеріалів

Вино-

матеріал

Кількість мікроорганізмів при

мікроскопіюванні

Хімічні

і органолептичні показники виноматеріалів

Попередня оцінка

Вино-

матеріал

В осаді після центрифу-

гіровання

У виноматеріалі

Хімічні

і органолептичні показники виноматеріалів

Попередня оцінка

Вино-

матеріал

Сума клітин

в 5-ті полях зору

Сума

клітин в

1 см3

Сума

клітин в 5-ті полях зору

Сума

клітин в

1 см3

Хімічні

і органолептичні показники виноматеріалів

Попередня оцінка

Необро-

блений

Менш 100

Менш

5х106

Менш 5

Менш

25х104

У відповідності

с нормативно- технічної документацією

здоровий

Необро-

блений

100 і більше

5х106

і більше

5 і більше

25х104 і

більше

У відповідності

с нормативно- технічної документацією

нестійкий

Необро-

блений

100 і більше

5х106

і більше

5 і більше

25х104 і більше

Масова концентрація

летучих кислот вище припустимої,* сторонній

тон у смаку й ароматі

хворий

Оброб-

лений

Менш 10

Менш

5х105

_

_

У відповідності

с нормативно- технічної документацією

здоровий

Оброб-

лений

10 і більше

5х105

і більше

_

_

У відповідності

с нормативно- технічної документацією

нестійкий

Оброб-

лений

10 і більше

5х105

і більше

_

_

Масова концентрація

летучих кислот вище припустимої,* сторонній

тон у смаку й ароматі

хворий

· – при тенденції до росту масової концентрації летучих кислот, незважаючи на їх припустимий початковий зміст, виноматеріал вважається «хворим»
КД……………………… 7
2.1.3 Оскільки метод підрахунку клітин не дає визначення фізіологічного стану мікроорганізмів, то при оцінці «нестійкий» і «хворий» для остаточного висновку варто визначити здатність їх до розмноження ( життєздатність при посіві в рідкі та щільні живильні середовища ). Контроль ведуть відповідно до таблиці 2.3.
2.1.4 Виноматеріал з оцінкою «нестійкий» піддають фільтрації й сульфітації. Виноматеріал, оцінений як «хворий», негайно обробляють за схемою: пастеризація не менш 10 хв, фільтрація, сульфітація до масової концентрації вільної SO2 25-30 мг/дм3. Через добу, оброблені в такий спосіб виноматеріали, піддаються ретельному мікробіологічному контролю (табл. 2.3) і використовуються у виробництві за висновком дегустаційної комісії.
2.2 Мікробіологічний контроль виноматеріалів на витримці та зберіганні, при складанні купажів і обезкислородження
Виноматеріали, використовувані для шампанізації повинні строго відповідати мікробіологічним вимогам тієї або іншої технологічної операції на наявність життєздатних клітин мікроорганізмів і присутність сторонньої мікрофлори відповідно до показників таблиць
2.1 і 2.3.
Таблиця 2.2 – Контроль обробки та витримки виноматеріалів, обезкислородження купажів

Об'єкт контролю

Місце і

періодичність контролю

Гранично припустимі

значення контрольованих параметрів

Метод контролю

1

2

3

4

Оброблений

виноматеріал на зберіганні, купаж

Кожна ємкість

Не рідше одного разу на місяць

Не більше 5 клітин

дріжджів в 5 полях зору. Сторонні мікроорга- нізми не допускаються

Мікроскопування з

попереднім центрифугированням

( пп. 3.1.3-3.1.4, табл.2.1)

Відфільтровані

виноматеріали

Кожна ємність

після нової зарядки фільтра й у процесі роботи

Не допускається наявність

мікроорганізмів

Мікроскопування з

попереднім центрифугированням ( пп. 3.1.3-3.1.4)

При виявленні мікроорганізмів оцін- ку ведуть по табл. 2.3

КД……………………… 8
Продовження таблиці 2.2

1

2

3

4

Виноматеріал

для долівок

Кожна ємкість перед

долівкою

Не допускається наявність

мікроорганізмів

Мікроскопування з

попереднім центрифугированням ( пп. 3.1.3-3.1.4)

Готовий купаж

Кожна ємкість перед

зняттям з клею

Не допускається наявність

мікроорганізмів

Мікроскопування з

попереднім центрифугированням ( пп. 3.1.3-3.1.4)

Мікробіологічна оцінка на біологічну стійкість

( пп.3.1.5; табл 2.3)

Купаж на

обезкислород- живанні з дріжджевою розводкою

Не рідше одного

разу на тиждень

Суміш повинна містити

2-3 млн/см3 клітин дріжджів; мертвих не більше 5%, сторонні мікроорганізми не допускаються

Мікроскопіювання,

визначення фізіологи-

ного стану

дріжджів (пп. 3.1.3)

Обезкислород-

жений купаж

Не рідше одного разу

на тиждень

Допускається наявність

3-5 нежиттєздатних клітин дріжджів. Молочнокислі бактерії не допускаються

Мікроскопування з

попереднім центрифугированням ( пп. 3.1.4-3.1.5)

Фарбування препарату

(3.1.3)

2.2.1 При виявленні мікроорганізмів у препаратах обробленого ассамбляжа і купажу необхідні повторна фільтрація або перезарядження фільтра.
2.2.2 Для долівки резервуарів використовують вино мікробіологічно чисте і не молодше доліваємого.
2.2.3 Ассамбляжі, готові купажі, у тому числі й обескислородженні купажі, що перебувають на витримці й зберіганні, при наявності в центрифугованом осаді клітин мікроорганізмів обов'язково оцінюються на здатність до розмноження при висіві проби на живильні середовища і аналізуються відповідно до табл. 2.3.
КД……………………… 9
Таблиця 2.3 – Оцінка стійкості виноматеріалів до мікробіологічних помутнінь

Оцінка стану зразків

Час розвитку мікроорганізмів, доба

Оцінка стану зразків

Ріст у пробірках з виноматеріалом,

вином

Ріст молочнокислих бактерій

при посіві на живильну середу

Оцінка стану зразків

Дріжджів

уксуснокислих

бактерій або суміші уксуснокислих бактерій і дріжджів

з сорбиновою кислотою

з етанолом

Оцінка стану зразків

винних

сторонніх

(«диких»,

плівчатых)

уксуснокислих

бактерій або суміші уксуснокислих бактерій і дріжджів

з сорбиновою кислотою

з етанолом

Хворий

1 доба при

наявності плівки

1-2

3

3

Нестійкий

1-3

1-3

3-5

4-6

4-15

Стійкий

4

і більше

4

і більше

6

і більше

7

і більше

більше 15

2.2.4 Стійкість виноматеріалів і вин до мікробіологічних помутнінь визначають за часом розвитку мікроорганізмів (доба) у відібраній пробі при висіві в живильні середовища (табл.
2.3).
Для визначення присутності у відібраній пробі винних дріжджів, оцетовокислих бактерій і сторонньої дріжджової флори (плівчаті дріжджі) – 10 см3 проби наливають у стерильну пробірку з ватною пробкою або іншу яку-небудь стерильну ємкість і поміщають у термостат при температурі (26+1)оС. Ріст мікроорганізмів визначається візуально (плівка, помутніння) і мікроскопіюванням.
Виноматеріали й вина, інфіковані молочнокислими бактеріями, виявляють за часом розвитку їх після посіву на елективні живильні середовища . Досліджувану пробу в кількості
0,5 см3 висівають в одну з живильних середовищ для молочнокислих бактерій (з додаванням
сорбінової кислоти або етанола). В якості живильних середовищ використовують солодове сусло, яблучно-солодове сусло, розведене виноградне сусло, капустяне середовище (п.4.2). Елективні умови для молочнокислих бактерій створюють додаванням у середовище
КД……………………… 10
безпосередньо перед посівом етилового спирту з об'ємною часткою 14 % (0,95 см3 на 5 см3 середовища). Можна використовувати також дію сорбінової кислоти ( розчин сорбата натрію з масовою концентрацією 5 г/100 см3 з розрахунку 0,2 см3 на 10 см3 вина), що пригнічує ріст дріжджів та створення анаеробних умов для запобігання росту оцетовокислих бактерій (агарові пробки).
2.2.5 Хворим або нестійким вважається виноматеріал або вино, у якому виявлен ріст за певне число доби хоча б одного із зазначених у табл. 2.3 мікроорганізмів (дріжджів, бактерій). Непрямим показником хворого вина є масова концентрація летучих кислот, що перевищує припустиму, а також сторонні тони при органолептичній оцінці.
2.2.6 Виноматеріал, оцінений як «хворий», «нестійкий», обробляють за схемою, зазначеної в «Інструкції зі стабілізації виноградних вин».
2.2.7 Виноматеріали з високою тітруємою кислотністю й наявністю молочнокислих бактерій перевіряють методом паперової хроматографії на наявність яблучної кислоти (п.
3.2.1). При виявленні яблучної кислоти вирішується питання про залишення виноматеріалів для окремих типів вин для закінчення яблучно-молочного бродіння або запобігання цього процесу (наприклад, пастеризацією).
Виноматеріал, у якому проходить біологічне кислотонониженння, піддають мікробіологічному й хімічному контролю не рідше 1 разу в 10 днів за ГОСТ 13192, 14252,
14351, 13192.
Про початок яблучно-молочного бродіння свідчить різке збільшення кількості бактерій, зниження концентрації тітруємих кислот, підвищення концентрації летучих кислот. Залежно від температури і SO2 у вині завершується цей процес протягом 20 діб й більше. Про закінчення процесу яблучно-молочного бродіння судять по зменшенню плям яблучної кислоти на хроматограмі. По закінченні процесу інактівірують бактерії ( сульфітація до масової концентрації 30-50 мг/дм3 вільної SO2, пастеризація), потім проводять обклеювання, фільтрацію.
2.3 Контроль готування розводки чистої культури дріжджів
2.3.1 На всіх стадіях готування розводки чистої культури дріжджів обов'язковим є строге дотримання правил санітарії й здійснення мікробіологічного контролю.
2.3.2 Для приготування виробничої розводки дріжджів перші генерації розведення готовлять у заводській лабораторії. Сутність способу полягає в поступовому збільшенні маси дріжджів при 15 оС шляхом послідовних пересівань на все більшу кількість живильного середовища 5 генерацій. Останню генерацію звичайно ведуть у резервуарах із пристроєм, що перемішує, і використовують для готування виробничої розводки у дріжджеростильних апаратах способом, прийнятим на заводі.
КД……………………… 11
Таблиця 2.4 – Мікробіологічний контроль готування розводки чистої культури дріжджів

Об'єкт контролю

Місце і

періодичність контролю

Гранічно припустимі

значення контрольованих параметрів

Метод контролю

Розведення

чистої культури дріжджів

у заводський лабораторії

Остання генерація

розводки

У розводки при наявності

95% фізіологічно активних клітин допускається 3-5% мертвих.

Початкова концентрація клітин для завантаження розводки

у дріжджеростильний апарат повинна бути не менш 10 млн/см3 .

Мікроскопіювання,

фарбування препа-

ратів (3.1.2-3.1.3)

Живильне

середовище для дріжджі- ростильних апаратів

Після пастеризації

і фільтрації для кожної дріжджової розводки

Не допускається присутність

мікроорганізмів

Мікроскопування з

попереднім центрифугированням (3.1.3)

Дріжджова роз-

водка, яка отпускається на виробництво

Дріжджеростильний

апарат,

щодня

Розводка повинна містити

не менш 80 млн клітин в

1 см3, що почкуються

30-40%; мертвих не більше

5%.

Наявність сторонніх мікроорганізмів не допускається

Пряме мікроскопування,

фарбування препаратів,

підрахунок клітин

(3.1.2-3.1.4)

Повітря, яке

подається у дріжджанку

через знеплідню-

ючий фільтр

Після фільтра

2 рази на місяць

Не більше 5 колоній

мікроорганізмів на щільному живильному середовищі

Посів на щільне

живильне середовище

(3.3)

КД……………………… 12
2.3.3 Розводку дріжджів готовлять на стерильному середовищі з об'ємною часткою етилового спирту 10-11% , масовою концентрацією цукру 5-8 г/100 см3 і масовою концентрацією титруємих кислот 7-8 г/дм3 (купаж, що пройшов технологічну обробку).
Для перших генерацій живильне середовище в заводській лабораторії нагрівають до температури 85-90 оС і витримують при цій температурі 15 хвилин.
Живильне середовище для приготування виробничої розводки пастеризують при температурі 70-75 оС або піддають фільтрації, що знепліднює.
2.3.4 Виробнича розводка чистої культури дріжджів до моменту введення в тиражну суміш повинна бути в стадії активного бродіння, містити в межах 80 млн/см3 клітин з мінімальним
числом мертвих, однорідних за формою й розмірами, у зваженому стані при пилоподібній структурі осаду й у невеликих скупченнях при зернистій або пластівчастій структурі осаду.
2.3.5 Для характеристики фізіологічного стану клітин дріжджів визначають:
- кількість клітин, що почкуються;
- відсоток співвідношення живих і мертвих клітин (фарбування метиленовим блакитним);
- зміст глікогену (фарбування розчином Люголя).
У циклі розвитку дріжджів визначають наступні стадії:
- розмноження – велика кількість клітин, що почкується, з однорідною цитоплазмою й тонкою клітинною оболонкою.
- бродіння – дріжджі перебувають у вигляді окремих клітин. Цитоплазма зерниста, дрібні вакуолі, є запас живильних речовин.
- відмирання – відставання цитоплазми від клітинної стінки. Відмерлі клітини здаються сильно деформованими.
- автоліз – клітини здаються порожніми, товщає оболонка, іноді розривається; у вині з'являється помутніння.
При повільному розвитку дріжджів рекомендується в живильне середовище вводити джерела азоту, наприклад: аміак (24%-ний розчин у кількості 2-3 см3/дал).
2.3.6 При заміні рідких розведень дріжджів на препарати активних сухих дріжджів (АСД) проводиться їхня перевірка на наявність живих активних клітин дріжджів і сторонньої мікрофлори. Їх реактивація проводиться відповідно до рекомендації виробника.
Препарати АСД гарної якості містять 15-30´109 і більше живих клітин в 1 г препарату, не містять сторонньої дріжджової й бактеріальної мікрофлори.
Кількість внесених у бродильну (тиражну) суміш дріжджів і їхній фізіологічний стан повинні відповідати вимогам табл. 2.6.
КД……………………… 13
2.4 Мікробіологічний контроль готування лікерів (тиражного, резервуарного,
експедиційного) і допоміжних виноматеріалів
2.4.1 Об'єктами мікробіологічного контролю є вода, оклеивающие речовини, танін,
сахароза, лимонна кислота, двоокис вуглецю (газоподібна).
2.4.2 Поступаючу на завод воду аналізують один раз на місяць. Аналіз води проводить санітарно-епідеміологічна служба.
2.4.3 Контроль чистоти повітря, виробничих приміщень і двоокису вуглецю проводять
1 раз на місяць.
2.4.4 Цукор і лимонна кислота, використовувані при готуванні лікерів можуть бути забруднені волокнами тканини пакувального матеріалу, іншими сторонніми включеннями, отже, що надходять на завод партії цих матеріалів перевіряють відповідно ГОСТ 5833, 2219.
2.4.5 Лимонна кислота, застосовувана для підкислення лікеру, повинна бути сухою, чистою, без сторонніх домішок. Контроль чистоти лимонної кислоти обмежується візуальним оглядом поступаючої на завод партії.
Таблиця 2.5 – Вимоги й мікробіологічна оцінка матеріалів при виготовленні лікерів

Об'єкт контролю

Місце і періодичність контролю

Гранічно припустимі

значення контрольованих параметрів

Метод контролю

Виноматеріал

Кожна партія

перед готуванням лікеру

Не допускається

наявність мікроорганізмів

Мікроскопування з

попереднім центрифугированням (3.1.3)

Цукор-пісок

Кожна партія при

прийманні у виробництво

Не допускається

наявність мікроорганізм мів і механічних включень

Підготовка проби,

посів на щільне живильне середовище. мікроскопіювання (3.1.2-3.1.5)

Лікер

Кожна партія за

4-5 доби до використання у виробництві

Не допускається

наявність мікроорганізмів

Посів на щільне

живильне середовище мікроскопіювання (3.1.2-3.1.5; 4.2.5)

КД……………………… 14
2.4.6 Присутність мікроорганізмів і сторонніх включень у лікерах не допускається.
2.4.7 Кожну партію окліювачих речовин, таніна та лимонної кислоти перевіряють при надходженні у виробництво. Вони не повинні містити мікроорганізмів, здатних розвиватися у винах і механічних включень.
2.5 Мікробіологічний контроль шампанізації виноматеріалів
2.5.1 Пляшковий спосіб
2.5.1.1 При завантаженні резервуарів або розливі тиражного резервуара необхідно попередньо перевірити чистоту комунікацій, устаткування, тари.
2.5.1.2 Якщо при гарному розмішуванні тиражної суміші в поле зору мікроскопа втримується менш 3-х живих клітин дріжджів, то процес бродіння може затриматися, отже кількість дріжджів треба збільшити.
Таблиця 2.6 – Контроль процесу виробництва ігристих вин пляшковим способом

Об'єкт

контролю

Місце і

періодичність контролю

Гранічно припустимі

значення контрольованих параметрів

Метод контролю

Тиражна суміш

Кожна партія

безпосередньо перед розливом у пляшки

Не менш 1 млн.клітин/см3 ,

мертвих клітин дріжджів не більше 5%, сторонні мікроорганізми не допускаються

Мікроскопування,

фарбування, підрахунок кількості клітин в 1 см3 (3.1.2-3.1.4)

Бродіння в

пляшках

Кожна однорідна

партія по бутам через кожні 10 діб до закінчення бродіння

Мертвих клітин дріжджів

не більше 7%,сторонні мікроорганізми не допускаються

Мікроскопіювання,

фарбування (3.1.2-3.1.4)

Кюве в процесі післятиражної витримки

Кожна

партія

при перекладці,

ремюаже

Оцінюється фізіологічний

стан дріжджів; сторонні мікроорганізми не допус- каються, спостерігається структура осаду в пляшці

Мікроскопіювання,

структура осаду оціню-

ється візуально

(3.1.2-3.1.4)

КД……………………… 15
Продовження таблиці 2.6

1

2

3

4

Готова продук-

ція після дегоржажа

Вибірково з

кожної партії

Вино не повинне містити

яких-небудь клітин мікроорганізмів і механічних часток

Мікроскопування з

попереднім центрифугированням; оцінка стійкості вина до мікробіального помутніння

(3.1.2-3.1.5; 3.2.2)

Контрольна

витримка

Кожна партія

-

Візуальна оцінка при

перегляді пляшок

2.5.1.3 Активність дріжджів у тиражній суміші перевіряють посівом 0,5 см3 тиражної суміші в пробірку з 4,5 см3 стерильного тиражного вина з масовою концентрацією цукру 10 г/100см3 і витримкою при 25 оС. Утворення дріжджового осаду в посівах через 2-3 доби свідчить про активний стан дріжджів.
2.5.1.4 При перекладках кюве в процесі послітиражної витримки мікробіологічний контроль передбачає спостереження за зміною структури осаду, його однорідності у верхніх і нижніх пляшках покладеного штабеля, за фізіологічним станом дріжджів і наявністю сторонньої мікрофлори в осадах.
При відхиленні від нормального плину ремюажа мікробіолог перевіряє якість осаду і встановлює причини.
2.5.1.5 Якщо встановили, що бродіння призупинилося, необхідно з'ясувати причину. Рекомендується перевірити кількість SO2 у вині, а також з'ясувати, чи були різкі зміни температури, протяги й т.п. При нормальних умовах життєдіяльності дріжджів і складу вина варто провести перекладку зі збовтуванням і створити сприятливі температурні умови.
2.5.1.6 Для повної характеристики дегоржируємої партії шампанського визначають характер масок і вмістюючі їхні елементи вибірковим мікроскопіюванням осаду й нальоту на внутрішній поверхні пляшки (мікроскопіювання при малому збільшенні відколотого шматочка скла).
2.5.1.7 Якість фільтрації експедиційного лікеру перевіряють перед дозуванням у пляшки.
2.5.1.8 Шампанське, використовуване для дозування, піддають мікробіологічному контролю.
КД……………………… 16
2.5.1.9 Готову продукцію піддають мікробіологічному контролю шляхом мікроскопіювання центрифугованної проби й посіву вина на щільне живильне середовище, а також випробуванню на мікробіальну стійкість вина (табл. 2.1, 2.3).
В окремих пляшках із шампанським (не більше 2 з 10 пляшок) допускається наявність не більше 2-х мертвих клітин мікроорганізмів і білкових часток.
2.5.2 Резервуарний періодичний спосіб
Таблиця 2.7 – Контроль виробництва ігристих вин резервуарним періодичним способом

Об'єкт

контролю

Місце і

періодичність контролю

Гранічно припустимі

значення контрольованих параметрів

Метод контролю

Бродильна

суміш в акратофорах

Кожний

резервуар

Після перемішування концен-

трація клітин дріжджів повинна бути 2-4 млн/см3 з долею життєздатних 95%.

Сторонніх мікроорганізмів не повинне бути

Мікроскопіювання,

фарбування, під- рахунок кількості (3.1.2-3.1.4)

Процес

вторинного бродіння

Кожний

резервуар

не рідше 1 разу у тиждень

На 3-4 добу (початок

заброжування) не менш 50 %

клітин, що почкуються.

На 7-16 добу – не менш 20 % клітин, що почкуються, мертвих не більше 10%

Мікроскопіювання,

фарбування, під- рахунок кількості (3.1.2-3.1.4)

Шампанізо-

ване вино

Перед розливом

При мікроскопіюванні

мікроорганізми відсутні

Мікроскопування з

попереднім центрифугированням; (3.1.2-3.1.3)

2.5.2.1 При виявленні навіть однієї дріжджової клітини в препараті варто взяти другу пробу. Якщо дані підтвердяться, необхідно перезарядити фільтр.
2.5.2.2 Допускається чергове проведення процесу шампанізації на дріжджах, що залишаються в акратофорі від попереднього бродіння, у випадку позитивного висновку мікробіолога про їхню якість і чистоту.
2.5.2.3 Стадії процесу (вторинного) бродіння в акратофорах характеризуються певним тиском CO2 : 7-16 доба – до 0,25 МПа; 17-24 доба – до 0,40 МПа.
КД……………………… 17
2.5.3 Безперервний спосіб
2.5.3.1 При виявленні в осаді центрифугированної проби мікроорганізмів у купажі після термообробки рекомендується зробити посів проби на щільне живильне середовище для уточнення життєздатності мікроорганізмів відповідно до табл. 2.4. При наявності живої мікрофлори, що інфікує, необхідно провести санітарну обробку й перезарядження фільтру.
Таблиця 2.8 – Контроль гристих вин при безперервному способі шампанізації

Об'єкт

контролю

Місце і

періодичність контролю

Гранічно припустимі

значення контрольованих параметрів

Метод контролю

Купаж для

шампанізації після термооб- робки

1 раз на місяць

Не допускається присутність

життєздатних мікроорганізмів

Мікроскопування осаду з

попереднім центрифугированням

з попереднім фарбуванням препарату

(3.1.2-3.1.4)

Купаж з

лікером

Передаточний

резервуар,

2 рази на місяць

Не допускається присутність

життєздатних мікроор-

ганізмів

Мікроскопування осаду з

попереднім центрифугированн з попереднім фарбуванням препарату

(3.1.2-3.1.4)

Бродильна

суміш

перед подачею на шампаніза- цію

Кожна ємкість

1 раз у тиждень

Концентрація клітин дріжджів

у суміші 3-5 млн/см3 з долею життєздатних – 95%

Сторонні мікроорганізми не допускаються

Мікроскопіювання,

фарбування препа-

рату; підрахунок клітин дріжджів

(3.1.2-3.1.4)

Процес

шампанізації вина

Не рідше 1 рази

у два тижні

Не допускається наявність

сторонньої мікрофлори. Загальна кількість клітин дріжджів із часток почкую- щихся і мертвих повинне бути згідно стадії непрерывного бродіння

Мікроскопування,

підрахунок клітин дріжджів і визначення фізіологічного

стану

(3.1.2-3.1.4)

КД……………………… 18
Продовження таблиці 2.8

1

2

3

4

Шампанізо-

ване вино на виході з уста- новки

Не рідше 1 разу у тиждень

Не повинне містити живих

клітин дріжджів і сторонньої мікрофлори

Мікроскопіювання

центрифугированої проби, фарбування препарату

(3.1.2-3.1.4)

Охолоджене

шампанізоване вино

З апарата для

обробки холодом

2 рази в рік

Присутність мікроорганізмів

(бактерій і дріжджів) не допускається

Мікроскопіювання

осаду центрифугированної проби

(3.1.2)

Шампанізо-

ване вино в приймальних апаратах

Прийомний

апарат

перед розливом

Присутність будь-якого виду

і роду мікроорганізмів виключається

Мікроскопіювання

осаду центрифугированної проби

(3.1.2)

2.5.3.2 У процесі шампанізації вина в потоці рекомендується контролювати фізіологічний стан дріжджів у суспензії й в осаді. Якщо дріжджі в суспензії живі, але в пригнобленому стані, не почкуються, то можливою причиною є недолік азотного харчування. У такому випадку рекомендується азотне підживлення шляхом введення розчину аміаку й амонійних солей.
2.5.3.3 Шампанізоване вино в прийомних апаратах перед розливом рекомендується періодично перевіряти на мікробіологічну стійкість шляхом посівів у рідкі й на щільні живильні середовища (табл.2.4).
2.6 Контроль розливу гристих вин у пляшки
2.6.1 Шампанське, що надходить із фільтра на розлив, піддають мікробіологічному аналізу протягом усього часу розливу. Важливим є якість вимитих пляшок і відібраних пробок
2.6.2 Якість мийки пляшок, приготовлених для наливу, контролюють шляхом зовнішнього огляду й мікроскопіювання змивної води.
2.6.3 Пробки, відібрані для укупорки пляшок з вином, повинні бути без стороннього запаху,
механічних часток і мікроорганізмів.
КД……………………… 19
Таблиця 2.9 – Мікробіологічний контроль пляшок і пробок

Об'єкт

контролю

Місце і

періодичність контролю

Гранічно припустимі

значення контрольованих параметрів

Метод контролю

Пробки

Склад, цех розливу

при прийманні;

1 раз у зміну при подачі на розлив;

1 раз на місяць протягом зберігання

Змивна вода повинна бути

прозорою й безбарвною, наявність мікроорганізмів не допускається

Мікроскопіювання з

попереднім центрифугированням змивної води (3 проб- ки обмивають в 50 см3 стерильної води)

(3.1.2-3.1.4)

Пляшки

Цех розливу,

перед подачею на розлив,

1 раз у зміну

Змивна вода повинна бути

прозорою й безбарвною, наявність мікроорганізмів не допускається

Мікроскопіювання з

попереднім центрифугированням змивної води (внут- рішню поверхню

2 пляшок обмивають в 50 см3 стерильної води)

(3.1.2-3.1.4)

2.6.4 Якість фільтрації кожної партії шампанського з розливної машини контролюють безупинно, поки мікробіолог не впевниться в гарній фільтрації, що характеризується відсутністю клітин мікроорганізмів в осаді центрифугированної проби.
При виявленні навіть однієї клітини в 5 полях зору мікроскопа обов'язково беруть повторну пробу. Якщо при повторному контролі в препараті виявляють клітини мікроорганізмів, розлив зупиняють для перезарядження фільтра.
2.6.5 Перед надходженням готової продукції на зовнішнє оформлення, відібрані зразки від кожної партії піддають мікробіологічному контролю шляхом мікроскопіювання центрифугированної проби, а також випробуванню на мікробіологічну стійкість (табл. 2.3).
2.7 Контроль готової продукції
2.7.1 Висновок про стан шампанського кожного тиражу або резервуара дається на підставі попередньо отриманих даних лабораторного контролю при розливі або дегоржаже. Тому мікробіологічний контроль при витримці шампанського проводиться лише за вказівкою головного шампаниста.
КД……………………… 20
2.7.2 У випадку помутніння шампанського або утворення в ньому осаду, а також при поверненні з торговельної мережі, мікробіолог визначає характер помутніння прямим мікроскопіюванням після центрифугировання.
2.7.3 Кожна помутніла партія шампанського проглядається для визначення зовнішнього вигляду мутного вина з осадом. Якщо вид осаду однорідний, беруть пляшку, обережно відкривають її, і частину вина зливають. Залишок ретельно перемішують, відбирають пробу й центрифугують. Після цього осад мікроскопіюють і визначають його характер.
2.8 Контроль допоміжних матеріалів
2.8.1 Об'єктами мікробіологічного контролю є вода, окліювающі речовини, танін, фільтрпластині, що фільтрують матеріали, пробки, цукор, лимонна кислота й ін. Контроль виробляється якщо буде потреба при надходженні на завод.
2.8.2 Поступаюча на завод вода піддається контролю 1 раз на місяць. Аналіз води проводить санітарно-епідеміологічна служба.
2.8.3 Про чистоту допоміжних матеріалів судять по зовнішньому огляді (на присутність механічних забруднень і стороннього запаху) або по відсутності в ополосках змивної води мікроорганізмів, шкідливих для виноробного виробництва, що виявляються мікроскопіюванням і дающих ріст на відповідних середовищах.
2.8.4 Контроль окліювачих речовин може бути обмежений мікроскопіюванням об'єкта при надходженні його у виробництво. Для цього в 1 г сухого клею (желатину), узятого стерильно із середньо відібраної проби, вносять 10 см3 стерильної води. Після ретельного п'ятихвилинного збовтування частину проби центрифугують і переглядають під мікроскопом.
2.8.5 Перевірка фільтрпластин здійснюється при мікроскопіюванні вина щораз при зарядці фільтра, після пропущення перших порцій вина й досягнення його повної прозорості.
У випадку виявлення мікроорганізмів або механічних домішок необхідно перевірити складання фільтра й усунути дефекти.
2.8.6 Контроль цукру й лимонної кислоти описаний у розділі 2.4.
2.8.7 Контроль чистоти повітря виробничих приміщень проводять 1 раз на місяць
(п. 3.3) за ГОСТ 12.1.005, 17.2.3.01.
2.9 Контроль санітарного стану приміщень, технологічного обладнання і резервуарів
2.9.1 Виробничі приміщення контролюють один раз у тиждень по зовнішніх ознаках шляхом огляду поверхні резервуарів, стін, стель, підлог.
2.9.2 Порядок проведення санітарної обробки технологічного обладнання, винопроводів,
інвентарю та приміщень у виноробній промисловості встановлюється РД 202.13.027-99.
КД……………………… 21
Таблиця 2.10 – Мікробіологічний контроль обладнання і технологічної тари

Об'єкт

контролю

Місце і

періодичність контролю

Гранічно припустимі

значення контрольованих параметрів

Метод контролю

Обладнання,

призначене для проведен- ня технологіч- них операцій

Кожний вузол тех-

нологічної

схеми після мій-

ки й обробки

При мікроскопіюванні допус-

кається наявність 1-2 мертвих клітин мікроорганізмів або спор цвілевих грибів не в кожному полі зору

Мікроскопіювання

мазка, узятого з по-

верхні площею

10х10 см2 , фарбування

(3.1.2-3.1.4)

Резервуари,

бочки, бути, акратофори та ін.

кожна одиниця

технологічної тари після кожної мийки та

обробки

Змивна вода повинна бути

прозорою та безбарвною, при мікроскопію ванні – до 1-2 мертвих клітин дріжджів або спор цвілевих грибів не в кожному полі зору

Мікроскопіювання з

попереднім центрифугированням останньої змивний води контрольованого об'єкту, фарбування (3.1.2-3.1.4)

3 ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ І МІКРОБІОЛОГІЧНОГО АНАЛІЗУ

3.1 Методи мікробіологічного контролю
3.1.1 Відбір та підготовка проб до аналізу
Відбирають середню пробу від однорідної партії виноматеріалу за правилами,
передбаченими ДСТУ 14137.
Якщо виноматеріал довгий час залишався в стані спокою, проби необхідно відбирати з різних слоїв, у тому числі й з осаду. Для цього користуються попередньо обробленими спиртом гумовими шлангами або пробовідбирниками, які після кожного відбору проби варто промити чистою водою, а потім досліджуваним виноматеріалом. Після відбору проб з інфікованих виноматеріалів шланги й пробовідбирники необхідно обполіскувати водою, потім спиртом і користуватися ними повторно не раніше, ніж через 5 хвилин.
У випадку неможливості відбору проби через верхній отвір ємкості пробу можна відбирати з нижнього крана. Поверхню закритого крана обробляють спиртом або обпалюють полум'ям спиртівки (факелу). Перед відбором проби зливають 5-10 см3 виноматеріалу, залежно від наявності застійних зон у місці відбору проби.
КД……………………… 22
При оцінці мікробіологічного стану виноматеріалу методом посіву на живильні середовища пробу беруть із дотриманням правил стерильності.
Пробу відбирають у стерильний посуд (пробірки, колби). Перед узяттям зразка посуд звільняють від ватної пробки, обпалюють горловину, наповнюють і, перед тим, як закрити, знову обпалюють горловину й пробку. Наповнюють колбу не більше ніж на 1/3 об'єму, щоб випадково не змочувалася пробка при збовтуванні. Перед центрифугированням, мікроскопуванням або посівом відібрану пробу ретельно перемішують. Мікробіологічний аналіз проб рекомендується проводити негайно після добору, але не пізніше, ніж через 2 год за
умови зберігання зразків у холодильнику при температурі (6+1) оС, а при контролі
кількісного складу мікрофлори – не пізніше, ніж через 20 хв.
Мікробіологічне дослідження проводять шляхом мікроскопування, а при необхідності більше поглибленого аналізу проводять посіви на рідкі або щільні живильні середовища.
3.1.2 Техніка мікроскопування.
3.1.2.1 Світлопольна мікроскопія.
Найбільш поширені і зручні в заводських мікробіологічних лабораторіях біологічні оптичні, світлопольні мікроскопи з окулярами x7, x10, x15, x20 і об'єктивами x10, x20, x40, x90 з найбільшим збільшенням в 1350 рази. Світлопольну мікроскопію використовують при підрахунку числа клітин, орієнтовного визначення систематичних груп мікроорганізмів, для вивчення морфології клітин у нефарбованих і пофарбованих спеціальними барвниками препаратах, а також для перевірки чистоти аналізованої проби. Розглядають препарат при збільшенні мікроскопа 15x40, 20x40.
3.1.2.2 Люмінесцентна мікроскопія.
Принцип люмінесцентної мікроскопії заснований на здатності мікроорганізмів світитися під впливом падаючі на них світла. Люмінесценцію можна спостерігати за допомогою звичайного мікроскопа, установивши на шляху яскравого джерела світла світлофільтр, що пропускає синьо-фіолетові промені, що викликають люмінесценцію частин препарату, здатних світитися. Синє світло, що збуджує цю люмінесценцію, значно яскравіше її самої; тому, щоб поле зору не засвітчивалось, використовують додатковий жовтий світлофільтр. Для мікроскопічних досліджень випускаються спеціальні люмінесцентні мікроскопи. Препарати мікроорганізмів можна обробити спеціальними барвниками – флуорохромами, одержавши вторинну флуоресценцію, тобто здатність клітин або окремих органелл яскраво світитися.
Люмінесцентна мікроскопія застосовується для виявлення живих і мертвих клітин мікроорганізмів, вивчення їхньої будови. Флуорохром вільно проникає усередину клітини, надаючи клітинним органеллам характерне світіння. Найбільш придатними для прижиттєвої обробки мікроорганізмів є наступні флуорохромы:
КД……………………… 23
- примулін, за допомогою якого розрізняють живі та мертві клітини (у живих клітин світиться тільки оболонка, мертві яскраво світяться);
- акрідіновий оранжевий, зв'язуючись із білками протоплазми, надає їм темно-зелене світіння;
- аурофосфин акумулюється мітохондріями, що яскраво світяться золотавим світлом.
3.1.3 Готування препаратів для мікроскопування
3.1.3.1 Для мікроскопування препаратів застосовують предметні стекла розміром 76x26 мм, товщиною (1,2±0,2) мм, предметні стекла розміром 18x18 мм або 24x24 мм і товщиною (0,16±0,01) мм. Нові предметні стекла для роботи (у неспецифічних бактеріальних лабораторіях) досить промити в гарячому мильному розчині, потім водопровідною водою і ретельно – дистильованою водою. Стекла, що були у вживанні, обполіскують теплою водою, миють у мильному розчині, ретельно промивають водопровідною, а потім дистильованою водою. Стекла сушать у сушильній шафі й зберігають у судині із кришкою або щільно загорненими в папір.
Покривні стекла зберігають у бюксах з етиловим спиртом.
3.1.3.2 Клітини мікроорганізмів беруть бактеріологічною петлею або стерильною піпетками. Стерилізують петлю в полум'ї спиртівки або газового пальника.
При мікроскопуванні з попереднім центрифугованням 10 см3 досліджуваного матеріалу
центрифугують при частоті обертання 25 с-1 (1,5х103 об/хв) 5 хв. Зливають надосадову рідину й з осаду готовлять препарат «роздавлена крапля». На чисте знежирене предметне скло стерильною петлею поміщають краплю досліджуваного матеріалу і накривають покровним склом. Крапля повинна бути невеликою, щоб рідина не виступала за краї покривного скла. Надлишок рідини, що вийшов з-під покривного скла, видаляють смужками фільтрувального паперу.
При мікроскопуванні культури з щільного живильного середовища на предметне скло попередньо наносять краплю стерильної водопровідної води. Препарат для спостереження в роздавленій краплі використовують для встановлення форми клітин мікроорганізмів, їхніх розмірів, структури, рухливості, характеру розмноження, а також для вивчення основних груп мікроорганізмів виробництва вин (див. Додаток А).
3.1.3.3 Мікроорганізми можна спостерігати як у незабарвленому виді, так і із прижиттєвим фарбуванням. Для фарбування препаратів використовують мало концентровані розчини різних фарб, які не роблять на клітини згубної дії, дифференціально офарблюють уміст клітини й сприяють більш точному вивченню форми і клітинних структур.
Живі й мертві клітини дріжджів і бактерій визначають при фарбуванні нейтральною червоною або метиленовою синьою концентрацією від 0,001 до 0,0001%. Невелику краплю
КД……………………… 24
барвника вводять під покривне скло або мікроорганізми вносять у краплю фарби на предметному склі й накривають покровним склом. Живі клітини не офарблюються, а мертві – офарблюються у цвіт барвника. Волютин у вакуолях клітин дріжджів випадає у вигляді яскраво пофарбованих синіх або червоних кульок. (Готування мителенового синього. Розчиняють 3 г фарби в 100 см3 етилового спирту з об'ємною часткою 96%. Через 2-3 дня з нього готовлять розведені водяні розчини у відношенні 1:10, 1:40, 1:300).
Для прижиттєвого фарбування використовують розчин Люголя (0,33 г йоду кристалічного й 0,66 г йодистого калію розчиняють в 100 мол дистильованої води). Глікоген у клітинах офарблюється йодом у червоно-бурих цвіт.
3.1.4 Методи визначення загального числа клітин мікроорганізмів.
3.1.4.1 Для визначення концентрації (числа клітин) мікроорганізмів в 1 см3 рідині роблять підрахунок їх під мікроскопом у рахунковій камері ( Тому-Цейса, Горяева й ін.). Рахункові камери мають вигляд товстого предметного скла, у центрі якого перебуває скляна пластинка з вигравіруваної на ній сіткою (або дві сітки на розділеній навпіл пластинці). Праворуч і ліворуч від центральної пластинки перебувають дві інші пластинки, рівень яких на 0,1 мм вище. При збільшенні мікроскопа 15х40 у полі зору мікроскопа міститься один великий квадрат рахункової камери, що складається з 16 маленьких квадратів або не розділений на маленькі квадрати.
3.1.4.2 Після ретельного перемішування пробу вина беруть сухою скляною паличкою або петлею; наносять на сітку рахункової камери, накривають спеціальним шліфованим покривним склом товщиною 0,25-0,35 мм та притирають його до появи райдужних кілець на бічних частинах.
Підраховують всі клітини мікроорганізмів, що перебувають усередині великого квадрата, а також клітини на прикордонних лініях, якщо більша їхня частина перебуває в даному квадраті. Клітини, більша частина яких перебуває в іншому квадраті, не підраховують. Якщо клітини перетинаються прикордонною лінією навпіл, то їх лічать тільки на двох суміжних сторонах квадрата, наприклад, на лівій і нижній. У кожному препараті підраховують клітини в п'яти великих квадратах, наприклад, по кутах і в центрі сітки. Занадто густі суспензії варто розбавляти водою в такому співвідношенні, при якому кількість клітин в одному великому квадраті буде не більше 30. Для вірогідності результату підрахунку необхідно зробити не менш
3-4 препаратів. Розрахунок числа мікроорганізмів в 1 см3 досліджуваного субстрату проводять
по формулі
М=а х 50000 х n, ( 1)
де М – кількість клітин мікроорганізмів в 1 см3 суспензії;
а – сума клітин мікроорганізмів у п'яти великіх квадратах (середня величина);
КД……………………… 25
n – кратне розведення вихідної суспензії мікроорганізмів;
50000 – коефіцієнт перерахування обсягу п'яти великіх квадратів на 1 см3
Для підрахунку загальної кількості клітин дріжджів, що утворять конгломерати, рекомендується в досліджувану пробу додавати рівну кількість сірчаної кислоти з масовою часткою 10% з подальшим ретельним перемішуванням для роз'єднання скупчення клітин. Підраховуючи результати, варто враховувати дворазовий ступінь розведення сірчаною кислотою.
3.1.4.3 При диференційованому підрахунку почкованих, живих і мертвих клітин дріжджів на сітку поміщають краплю досліджуваної дріжджової суспензії, додають краплю водяного розчину барвників нейтрального червоною або метиленовою блакитного з масовою концентрацією 0,01 г/100 см3 , перемішують, покривають покривним склом , притирають його.
Підраховують окремо кількість клітин, що почкуються, живих і мертвих, враховуя при
цьому дворазовий ступінь розведення розчином барвника. Отримані дані виражають у млн.клітин в 1 см3 або у відсотках до загальної кількості.
3.1.4.4 Орієнтовний підрахунок кількості клітин. Для визначення загальної обсемененности об'єкта підраховують кількість мікроорганізмів в 10 полях зору препарату «роздавлена крапля», пересуваючи препарат по діагоналі. Потім рахують середню кількість клітин в одному полі зору. При необхідності визначення кількості клітин в 1 см3 розрахунок роблять по формулі, використовуваної при підрахунку в рахунковій камері.
При окремому підрахунку в суспензії клітин, живих і мертвих, у пофарбованих препаратах
«роздавлена крапля» також ураховують дворазовий ступінь розведення барвником і отримані дані виражають у млн.клітин в 1 см3 або у відсотках до загальної кількості.
3.1.4.5 Кількісний облік життєздатності мікроорганізмів на щільних середовищах. Сутність методу полягає у висіві певного обсягу досліджуваної суспензії мікроорганізмів на щільне живильне середовище в чашки Петри з наступним підрахунку числа вирослих колоній. При цьому приймають, що кожна колонія утвориться при розмноженні однієї клітини ( дріжджів, молочнокислих і оцетовокислих бактерій). Цей метод дозволяє вести облік тільки життєздатних клітин мікроорганізмів.
При великому обсемененні мікроорганізмами проб (зразка), для посіву їх розбавляють, готовлять розведені суспензії. Ступінь розведення визначається передбачуваною кількістю мікроорганізмів у зразку, і відповідно число розведень тим більше, чим більше мікроорганізмів у субстраті. При аналізі беруть стерильно 1 см3 проби і містять в 9 см3 стерильної водопровідної води або фізіологічного розчину. Потім послідовно новою піпеткою переносять по 1 см3 у ряд пробірок з 9 см3 стерильної водопроводної води, щораз використовуючи нову стерильну піпетку.
КД……………………… 26
З отриманих розведень, попередньо ретельно перемішаних, роблять висів на поверхню агарової пластинки в чашки Петри. Посів роблять стерильними піпетками, по 0,05; 0,1; 0,2 см3 , починаючи з найбільшого розведення, при цьому може застосовуватися для посіву одна стерильна піпетка. Обсяг внесеної суспензії розподіляють по поверхні середовища стерильним шпателем, при цьому також для іншої чашки Петри беруть новий стерильний шпатель. Засіяні чашки Петри поміщають у термостат при температурі (26 +1) оС , сприятливої для розвитку мікроорганізмів, що враховуються.
Підрахунок вирослих колоній проводять через 3-5 доби. Рахують колонії, не відкриваючи чашки Петри, повернувши їх догори дном. Для рахунку беруть ті чашки, на якій колонії добре відділені одна від іншої. Кожну відлічену колонію позначають крапкою з нижньої сторони чашки Петри чорнилом або маркером. При великій кількості колоній дно чашки ділять на сектори, підраховують колонії в кожному секторі й результати підсумують.
Кращим розведенням уважається те, при висіві якого на щільному живильному середовищі виростають від 50 до 150 колоній. Якщо число вирослих колоній менше 10, то ці результати відкидають. Бажано, щоб загальна кількість підрахованих колоній при висіві з даного розведення було не менш 300.
Знаючи кількість вирослих колоній і ступінь розведення, визначають кількість мікроорганізмів в 1 см3 досліджуваного зразка. По морфології вирослих колоній (при перегляді в лупу) можна судити не тільки про чисельність мікроорганізмів, але й про їхню розманітність у досліджуваному зразку.
3.1.5 Визначення життєздатності культур мікроорганізмів.
Життєздатність мікрофлори відібраних проб зразків вина визначають по росту в рідкіх та на щільних живильних середовищах (табл. 2.3).
3.1.5.1 При росту в рідких середовищах мікроорганізми викликають помутніння, утворять осад, кільце або різний характер плівки. Про фізіологічний стан мікроорганізмів судять по швидкості появи видимого росту, а про групову приналежність – по характері росту, виду колоній і даних мікроскопування. Плівчати дріжджі й оцетовокислі бактерії дають характерні плівки на поверхні рідкого середовища. Молочнокислі бактерії ростуть у всій товщі рідкого середовища з утворенням шовковистих муарових хвиль при струшуванні (див. живильні середовища, що рекомендуються, для росту культур і диференціації дріжджів, оцетовокислих і молочнокислих бактерій ).
3.1.5.2 Метод мембранної фільтрації.
Метод заснований на виділенні дріжджів і інших мікроорганізмів з досліджуваного вина за допомогою фільтрації через мембранний фільтр із певним розміром пор. Даний метод дозволяє досліджувати відносно великі обсяги продукту, а також виділяти та ураховувати мінімальні
КД……………………… 27
кількості мікроорганізмів, які містяться в продукті. Це досягається втриманням клітин на поверхні мембран і наступним їхнім вирощуванням.
Значна перевага методу полягає в тому, що цим методом можна відокремлювати мікроорганізми від їхніх метаболітів і інгібіторів, що знаходяться у фільтрованом вині або іншому субстраті. При цьому виключається інгібіровання культур і створюються кращі умови для їхнього вирощування на селективних середовищах і наступній ідентифікації.
Для проведення аналізу використовують фільтрувальний прилад, наприклад, з нержавіючої сталі, з колбою для фільтрату й насосом. Перед кожним застосуванням фільтрувальний прилад повинен бути стерилізований в автоклаві або оброблений спиртовим розчином з об'ємною часткою спирту 70%. Мембранний фільтр за допомогою, обпаленого в полум'ї пальника пінцета, поміщають у гніздо приладу.
Горлечко пляшки ретельно обробляють, і її вміст фільтрують. При цьому присутні в продукті мікроорганізми затримуються на фільтрі за рахунок ситового ефекту. Потім, для видалення речовин, які інгібірують ріст мікроорганізмів, через фільтр пропускають невелику кількість стерильної води або фізіологічного розчину.
Фільтрацію закінчують коли на поверхні фільтру не залишається вологи. Одразу після закінчення фільтрації стерильним пінцетом фільтр переносять на щільні поживні середовища нижнєю стороною так, щоб вона повністю торкалася поверхні середи.
Посіви термостатірують при температурі (24±2) оС. По закінченні вирощування
досліджують культури під мікроскопом і підраховують кількість колоній, перераховуючи його на обсяг профільтрованого продукту.
За допомогою мембранної фільтрації можна кількісно визначати різні групи мікроорганізмів. Для цього використовують мембранні фільтри з відповідним розміром пор.
3.2 Контроль процесу яблучно-молочного бродіння
3.2.1 Метод паперової хроматографії
Контролюють процес хроматографічним методом визначення у виноматеріалах винної,
яблучної й молочної кислот.
3.2.1.1 Реактиви.
Розчинник. Готовлять суміш, до складу якої входять (в об'ємних частках) н-бутіловий спирт –40%; мурашина кислота концентрації 85% – 10%; вода – 50%. Суміш збовтують у ділильній воронці або колбі протягом 10-15 хв і залишають у воронці на добу для розшаровування. Верхній шар використовують для хроматографування. Роботу проводять у витяжній шафі.
КД……………………… 28
Проявник. Бромфеноловий синій масової концентрації 0,5 г/дм3 у спирті-ректифікаті. На кожні 250 см3 проявника додають розчин NaOH молярної концентрації 0,1 моль/дм3 для доведення величини рН до 8,0.
Для готування свідків (чистих розчинів кислот) розчиняють по 30 мг кислоти в 5 см3 спирту-ректифікату. Для готування розчину молочної кислоти розчиняють 1-2 краплі молочної кислоти масової концентрації 50 г/100 см3 в 5 см3 спирту-ректифікату.
3.2.1.2 Матеріали й посуд.
Папір хроматографічний, эксікатор діаметром 20 см і більше, капіляри для нанесення крапель.
3.2.1.3 Техніка проведення аналізу.
Із хроматографічного паперу вирізують коло по діаметру эксікатора, у центрі описують окружність діаметром 2,0 см, на якій відзначають крапки на відстані 1,5 см одна від іншої.
Поклавши коло на рівну скляну поверхню, вино й розчини свідків набирають у мікропіпетки або капіляри й краплями наносять у відзначені крапки. Розмір плями на папері повинен бути не більше 3 мм. Кожну наступну краплю наносять після висихання попередньої. Розчини свідків наносять у кожну крапку 5-6 разів, досліджуване вино – 6-8 разів.
Після висушування (вентилятором, феном) у центр кола вставляють смужку хроматографічного паперу шириною 1 см і висотою ледве більше висоти чашки Петри.
Чашку Петри з розчинником поміщають в ексикатор. Вільний кінець смужки, вставлений в коло, опускають у розчинник. Ексикатор герметично закривають кришкою й установлюють на строго горизонтальну поверхню в приміщенні з температурою (18-20) оС у витяжній шафі.
Коли розчинник пройде відстань 7-8 см від центру, розділ вважають закінченим. Паперове коло витягають, висушують у витяжній шафі до зникнення запаху мурашиної кислоти й обприскують розчином проявника з пульверизатора.
3.2.1.4 Кислоти-свідки розташовуються по радіусу в наступному порядку: винна, яблучна, молочна. Для ідентифікації плям кислот відміряють відстань від крапки нанесення краплі до початку плями. Порівнюють цю відстань із відстанню, пройденою відповідним свідком. Ідентичні кислоти проходять однакову відстань.
3.2.1.5 Контроль яблучно-молочного бродіння цим методом зводиться до спостереження за швидкістю утилізації яблучної кислоти молочнокислими бактеріями (зникнення плями яблучної кислоти на круговий хроматограмі й збільшення плями молочної кислоти). Повне зникнення яблучної кислоти свідчить про необхідність термінової обробки виноматеріалу з метою інактивації бактерій і їхніх видалень.
3.2.2 Метод контролю розвитку молочнокислих бактерій у рідкому середовищі під парафіновою пробкою.
КД……………………… 29
Колби місткістю 100 або 200 см3 з довгою каліброваною шийкою заповнюють засіяним живильним середовищем або досліджуваним вином до мітки й закривають (заливають) товстим шаром злегка підігрітої суміші, що складає 2/3 частини парафіну й 1/3 частини парафінового масла. Колби ставлять у термостат при (26±2)оС. Таке пристосування дозволяє спостерігати наявність вуглекислого газу, що утворюється під парафіновою пробкою та визначати його об΄єм.
Досліджувані проби попередньо звільняють від вуглекислого газу шляхом збовтування під вакуумом. Для попередження розвитку дріжджів у вино вводять сорбинову кислоту.
Зникнення яблучної кислоти та зниження показника титруємих кислот варто підтвердити аналітично, тому що утворення вуглекислого газу навіть без участі дріжджів не можна розглядати як специфічне явище яблучно-молочного бродіння.
3.3 Мікробіологічний контроль повітря.
Мікробіологічне дослідження повітря проводять седиментаційним методом, заснованим на осіданні мікробних клітин на щільному живильному середовищі в відкритій чашці Петрі. Для цього в стерильні чашки Петрі розливають агарізоване середовище – солодове сусло, м'ясо- пептоний агар (МПА). Після затвердіння середовища, загорнені в стерильний папір чашки Петрі переносять у цех для дослідження. Залежно від передбачуваного бактеріального забруднення повітря чашку витримують 5, 10, 15 хв відкритою, а потім ставлять у термостат на 3-5 доби при (26±1) оС і підраховують вирослі колонії.
Встановлено, що протягом 5 хв на чашку площею 100 см2 осідає стільки мікроорганізмів,
скільки їх утримується в 10 дм3 повітря.
Виходячи із цього, підраховують кількість мікроорганізмів в 1 м3 повітря по формулі
Х = А· 5 · 100· 100/S · К; (2)
Де Х – число мікроорганізмів у повітрі, млн клітин/м3
100 – число для перерахування площі чашки, см2;
100 – число для перерахування 10 дм3 повітря в 1 м3;
А – кількість вирослих колоній на чашці Петрі; S – площа чашки, см2
К – тимчасовий коефіцієнт, якщо чашка відкрита 5 хв –1; 10 хв – 2; 15 хв – 3;
Цей метод не дає точних кількісних показників забруднення повітря, але при однакових умовах аналізу можна одержати порівняльні дані.
При аналізі повітря, що надходить у дріжджові апарати, не завжди є можливість внести чашку Петрі у воздуховід зі знеплідненим повітрям, у цьому випадку використовують колбу
типу промивалки. На дно колби наливають 10-12 см3 агарізованій живильній середи з
гумовою трубкою, закритою ватяною пробкою, стерилізують в автоклаві. Після застывания
КД……………………… 30
живильну колбу середовища через гумову трубку приєднують до воздуховоду. Повітря пропускають через колбу протягом 2 година, після чого колбу закривають ватною пробкою та поміщають у термостат на 3-5 діб при (26+1) оС.
Якість очищення повітря, що подається в дріжджові апарати, можна також проміряти шляхом його барботування (пропущення) протягом 2 годин через колбу зі стерильною водопровідною водою і наступним посівом 1 см3 проби води на агарізоване середовище. Уловлювання клітин мікроорганізмів проводять, приєднуючи колбу до обвідної лінії воздуховода після фільтра. Таким же методом аналізують і двоокисвуглецю газоподібну, але час пропущення газу обмежується 20 хв.

4 ЗАГАЛЬНІ ВІДОМОСТІ ПРО РОБОТУ В МІКРОБІОЛОГІЧНІЙ ЛАБОРАТОРІЇ

4.1 Підготовка лабораторії
Мікробіологічні роботи проводять у спеціально обладнаному приміщенні з ізольованим входом. Якщо мікробіологічні роботи ведуться в спільній кімнаті технологічного контролю, то виділяють площу 6-8 м2 для боксу, у якому роблять всі роботи з посівами в стерильні середовища. Бокс відгороджують дерев'яними перегородками, заскленими на висоті 80 дсм від підлоги . В боксі встановлюють ламінар та стіл на кронштейнах, покритий лінолеумом або пластиком.
Дезінфекцію проводять дезінфікуючими препаратами, наприклад, 5 % –ним розчином хлораміну. Рекомендується також протирати поверхню стола ватним тампоном, змоченим розчином етилового спирту з об'ємною часткою спирту 70 %. Перед початком роботи бокс опромінюють бактерицидною лампою БУВ-15 або БУВ-30 протягом 30 хв. (перебування людей у приміщенні із включеною бактерицидною лампою забороняється).
Стіл для мікроскопування в лабораторії розташовують перед вікнами на північній стороні. У сонячні дні вікна в приміщенні завішують білими шторами для захисту від прямих сонячних променів, що стомлюють очі при мікроскопуванні та шкідливо діючих на мікроорганізми.
Для проведення мікробіологічного контролю в мікробіологічній лабораторії повинне бути необхідне устаткування, посуд, допоміжні матеріали й ін.
4.1.1 Мийка посуду.
Новий скляний посуд, пробірки, колби, склянки, чашки Петрі й ін. за ДСТУ 1717 промивають і занурюють на ніч в 1-2%-ний розчин соляної або сірчаної кислоти, потім ретельно прополіскують водою й висушують.
Посуд, що був у вживанні, миють у проточній теплій воді йоржами з використанням кальцинованої соди, напіврідкого мила, мильного розчину й синтетичних мийних засобів.
КД……………………… 31
Після ретельно обполіскують водопровідною, а потім дистильованою водою. Сильно забруднений посуд зі слідами жиру обробляють хромовою сумішшю (хромпиком).
Вимитий посуд сушать при кімнатній температурі в спеціальних кошиках або в сушильній шафі при температурі 100-105 оС. Чисто вимитий і висушений посуд, закритий ватними пробками з паперовими ковпачками або без них, зберігають у місцях, захищених від пилу, у шафах. Предметні й покривні стекла для готування препаратів повинні бути чистими й знежиреними. Для тонких мікробіологічних робіт нові й колишні у вживанні стекла ретельно миють сумішшю сірчаної кислоти із двухромовокислим калієм, водою, содовим розчином і ін. Для повсякденної роботи досить ретельно промити скло в мильній дистильованій воді, обмити чистою водою й витерти насухо чистою серветкою. Для знежирення чисто вимиті й сухі стекла протирають чистою ваткою, змоченою в ефірі, або обпалюють поверхню на полум'ї пальника.
Промиті стекла зберігають сухими, складеними в пакети (дезінфекція стекол у нашій області досліджень не потрібно), або в спирті в банці із притертою пробкою для особливих випадків мікроскопування.
4.1.2 Стерилізація посуду
Для стерилізації мікробіологічний посуд загортають у папір повністю або частково для збереження стерильності після прогрівання.
При підготовці піпеток до стерилізації в кінці, які беруть у рот, вставляють ватні тампони. Пастеровські піпетки загортають у папір по 3-15 штук. Градуйовані піпетки загортають у довгі смужки паперу шириною 4-5 см. Обмотку починають із кінця, що опускають у середовище. Піпетку обертають по спіралі й закінчують у кінця, що беруть у рот. Кінець паперу закручують або приклеюють. Піпетки можна загортати в лист паперу по 3-5 штук. На папері надписують обсяг загорнених піпеток і дату стерилізації. При наявності піналів піпетки стерилізують у них.
Пробірки перед стерилізацією закривають ватними пробками. Для стерилізації готовлять пакети пробірок, загорнених у папір, або ставлять пробірки в спеціальний кошик.
Для виготовлення пробок краще використовувати гігроскопічну вату, тому що вона не так сильно жевріє. Пробка повинна легко входити в пробірку й при вийманні з її не втрачати своєї
форми. Довжина пробки для звичайної пробірки близько 4 см. У пробірку пробка повинна входити на 1,5-2,0 см. Зручно для роботи обертати пробку чистою марлевою серветкою. Ватні пробки роблять із шару вати за ДСТУ 5556, скручуючи його руками на столі або на пінцеті, або на спеціальному апараті.
4.1.3 Стерилізація живильних серед
Рідкі й щільні живильні середовища, утримуючі цукри, стерилізують у кип'ятильнику Коха щодня по 20 хв. протягом 3-х діб, або в автоклаві згідно ДСТУ 19569 під тиском не вище 0,05
МПа (112оС) протягом 20 хв.
КД……………………… 32
Середовища, що не містять цукрів, стерилізують в автоклаві при тиску 0,1 МПа (121оС)
протягом 20 хв.
Зберігають живильні среди в прохолодному, захищеному від світла й не занадто вологому приміщенні.
Для стерилізації живильних середовищ, які змінюють свої властивості при нагріванні, можна використовувати холодну стерилізацію, що полягає у пропусканні їх через знеплюдніючі мікропористі фільтри, пристрій і матеріал яких забезпечує затримку мікроорганізмів (азбестові фільтри Зейтца, керамічні, порошкові, пресовані або мембранні фільтри).
Таблиця 4.1 – Методи стерилізації

Предмет

Підготовка до стерилізації

Режим і спосіб стерилізації

1

2

3

Держателі фільтрів

Упакувати в обгортковий

папір

В автоклаві:

при 121оС – 15 хв при 128оС – 10 хв при 134оС – 3 хв

Деталі до приладів, гумові

пробки, шланги

Упакувати в обгортковий

папір

Те ж

Піпетки дрібні й

предметні стекла

Укласти в циліндри,

Упакувати в обгортковий папір

У сушильній шафі при 160оС 2 год

Петлі й голки для посівів

культур, дрібні металеві інструменти

_

Прожарювання в полум'ї

пальника

Піпетки

Одиничні – упакувати в

папір; велика кількість – укласти в спеціальні пінали із кришками

У сушильній шафі при 160оС – 2 год при 170оС – 1 год

Пробірки

Закрити ватними пробками,

загорнути в папір по 10-20,

40 шт.

У сушильній шафі при 160оС – 2 год при 170оС – 1 год

Порожні скляні ємкісті,

закриті гвинтоподібними ковпачками з гумовими прокладками

Укласти в металеві

кошикі

В автоклаві

при 121оС 20 хв

Скляні флакони, склянки,

колби

Одиничні – закрити ватними

пробками з паперовими ковпачками; дрібні укласти у металеви кошики

У сушильній шафі при 160оС – 2 год при 170оС – 1 год

Чашки Петрі

Упакувати в обгортковий

папір кожну окремо або

по 5-10 шт, можна стерилізо-

вати у спеціальних етажерках

У сушильній шафі при 160оС – 2 год при 170оС – 1 год

КД……………………… 33
Продовження таблиці 4.1

1

2

3

Чисті центрифужні

пробірки, виготовлені з термолабільних матеріалів

-

Ультрафіолетове

опромінення з наступним зберіганням пробірок у стерильних судинах

Шпателі Дригальського

Загорнути в папір по одному

або трохи (до 5 шт.)

У сушильній шафі

при 160оС – 2 год при 170оС – 1 год

4.2 Готування живильних серед
4.2.1 Універсальні живильні . середовища
Солодове сусло. Неохмілене пивне сусло фільтрують через паперовий складчастий фільтр. Визначають масову частку сухих речовин 15-18%. Водопровідною водою розводять сусло до масової частки сухих речовин 6-8%; для молочнокислих бактерій – 2-5% при рН 5,0-6,0. При більше низькому рН сусло подщелачивають 10%-ним розчином NaHCO3 або гідроксида калія. Середовище фільтрують до блиску. Ущільнюють середовище додаванням 2%-ного агару за ДСТ 17206. Середовище призначене для вирощування дріжджів, молочнокислих і уксуснокислих бактерій.
Автолізат дріжджів. Готовлять із пресованих хлібопекарських дріжджів або відмитих осадових винних дріжджів. Для готування середовища автолІзат розбавляють водою в співвідношенні 1:10 з додаванням цукру з розрахунку масової концентрації 10-20 г/дм3 . Живильне призначене середовище для культивування дріжджів і молочнокислих бактерій.
Вино із цукром. Готовлять із білого сухого вина або обробленого купажу виноматеріалів з додаванням вакуум-сусла, сахарози або глюкози до масової концентрації цукру в середовищі від 20 до 50 г/дм3 і піддають пастеризації. Середовище призначене для культивування дріжджів, уксуснокислих і молочнокислих бактерій.

Дріжджова вода. 70-100 г свіжих пресованих або 7-10 г сухих дріжджів розмішують

в 1 дм3 дистильованої води й кип'ятять 30 хв. Після відстоювання на холоді у високому циліндрі протягом 12 годин рідину декантують і фільтрують. До фільтрату додають 1 дм3 води й ще раз кип'ятять 30 хв і знову фільтрують. Для кращої прозорості можна додати до кип'ятіння збитий з водою яєчний білок. рН середовища доводять до потрібного значення розчином кислоти й стерилізують при температурі (121+1)о С протягом 30 хв.
КД……………………… 34
Середовище використовується для вирощування дріжджів і молочнокислих бактерій.
Яблучне сусло. У свіжий або консервований яблучний сік додають при необхідності цукор до масової концентрації 10-12 г/100 см3 . Масова концентрація титруємих кислот не повинна перевищувати 6-7 г/дм3. При зайвій кислотності сік розбавляють водою. Стерилізують текучою парою 15-20 хв.
Середовище використовується для культивування дріжджів і молочнокислих бактерій

Капустяне середовище . 200 г здрібненої капусти в 1 дм води кип'ятять протягом

10-12 хв, віджимають, фільтрують, в 2 рази розводять водою й додають глюкозу до масової концентрації 2 г/100 см3 , пептон до масової концентрації 1 г/100 см3.
Можна використовувати суху капусту, висушену в тіні при температурі до 35о С. Для
готування середовища беруть 6-8 г сухої капусти й кип'ятять в 1 л води. Розливають у пробірки високим слоєм (по 8-10 см3). Стерилізують текучою парою 3 дні підряд по 30 хв або в автоклаві при 121о С протягом 30 хв.
Середовище призначене для росту та виділення молочнокислих бактерій.
Суміш солодового сусла з яблучним. До складу середовища входять: солодове сусло з масовою концентрацією сухих речовин 5 г/100 см3 – 1/2 обсягу і яблучне сусло – 1/2 обсягу. Середовище стерилізують текучою парою 3 доби підряд по 30 хв.
Середовище призначене для культивування молочнокислих бактерій.

Диференційно-діагностичне середовище з індикатором. Для роздільного визначення уксуснокислих і молочнокислих бактерій служить рідке або щільне живильне середовище, яке містить дріжджову воду, з додаванням 10%-ного дріжджового автолізата ( рн 7) і змішаного індикатора (бромкрезол червоний і бромкрезол зелений – 1:1). Молочнокислі бактерії утворять молочну й оцтову кислоти, у результаті чого реакція середовища стає кислою й цвіт індикатора міняється від синього через жовто-зелений до жовтого. При розвитку уксуснокислих бактерій утвориться аміак, що підщелачиває середовище й змінює його цвіт із синього у фіолетовий.

Для інгібирування росту плесеней, які інтенсивно ростуть на суслі й сусло-агарі, рекомендується додавати етиловий спирт, довівши його концентрацію до об'ємної частки 4% або 0,2% –ний розчин пропіоновокислого натрію.
Середовище АТБ (середовище Гарві). Середовище складається з пептону масової концентрації 10 г/дм3 ; дріжджового екстракту масової концентрації 5 г/дм3; 250 см3 томатного соку; MnSO4·4H2O масової концентрації 0,05 г/дм3 ; MgSO4·7 H2O масової концентрації
0,2 г/дм3 і розчини глюкози масової концентрації 10 г/дм3 , рН середовища доводять до 4,8.
Стерилізують середовище текучою парою 3 дні підряд по 30 хв або в автоклаві при 112о С протягом 20 хв. Середовище призначається для культивування молочнокислих бактерій роду Leuconostoc.
КД……………………… 35
4.2.2 Живильні для середовища культивування уксуснокислых бактерій.

Вино із суслом . До складу середовища входять по 1/3 обсягу столового сухого вина,

виноградного сусла й водопровідної води. Пастеризують середовище при 80о С протягом 15 хв.
Елективне середовище з антибіотиками. У живильному середовищі, яке містить 20 ед/см3 мономіцина при висіві проби досліджуваного вина розвиваються уксуснокислі бактерії. У присутності цього антибіотика молочнокислі бактерії не розмножуються.
4.2.3 Щільні живильні . середовища
Готовлять на основі рідких додаванням агару до масової концентрації
1,5 – 2,0 г/100 см3. Середовище краще ущільнюється й не відстає від скла при зберіганні,
якщо додати 10% желатину. Стерилізують середовища при температурі (121± 1)о С протягом
30 хв. У чашки Петрі розливають у гарячому виді з розрахунку 15-20 см3 на чашку.
Якщо рН середовища нижче 5,0 (виноградне сусло, яблучно-солодове сусло), то агар готовлять окремо, тому що при стерилізації в кислому середовищі агар гідролизуеться. При цьому масова концентрація водного агару повинна бути 3-4 г/100 см3 розраховуючи на його розведення середовищем. Агар стерилізують при температурі (121 ± 1)о С.
Перед розливом розплавлений водний агар змішують із рівною кількістю гарячого живильного та отриману суміш у теплому виді розливають на чашки Петрі або пробірки. Приготовлені в такий спосіб чашки використовують тільки після повного затвердіння живильного середовища.
Для одержання скошеного агару в пробірках, їх заповнюють розплавленим середовищем на 1/3 висоти пробірки й стерилізують. Перед посівом скошують, попередньо розплавивши.
4.2.6 Фізіологічний розчин.
0,85 г хлористого натрію розчиняють в 100 см3 дистильованої води й стерилізують при
(121± 1)о С протягом 20 хв.
4.2.7 Допускається застосування елективних середовищ вітчизняного й закордонного виробництва.
4.3 Засоби контролю й допоміжних пристроїв
Автоклав – за ГОСт 19569
Агар-агар – за ГОСТ 16280
Папір фільтрувальна – за ГОСТ 12026
Папір хроматографічний – по діючої НД Вата гігроскопічна – по діючої НД
Лійки скляні 4, 6, 8, 10 і 15 см3 – за ГОСТ 25336
Крапельниці – за ГОСТ 25336
Кислота сірчана – за ГОСТ 4204
КД……………………… 36
Колби – за ГОСТ 25336
Лупа – за ГОСТ 25706
Мікроскоп світловий біологічний – по діючої НД Піпетки градуйовані – 1,2,5,10 см3 - по діючої НД Піпетки Мору – за ГОСТ 25336
Палички скляні – за ГОСТ 25336
Пептон – по діючої НД
Потенціометр ( рн-метр лабораторний) – по діючої НД Пробірки біологічні, без ранта – за ГОСТ 25336
Спиртівки скляні або металеві – за ГОСТ 25336
Скла предметні – за ГОСТ 9284
Скла покривні – за ГОСТ 6672
Спирт-ректифікат етиловий – за ДСТУ 4221
Центрифуги лабораторні – по діючої НД Чашки Петрі – за ГОСТ 25336
Ексікатор – за ГОСТ 25336
Олівці для скла – по діючої НД
Лампи бактерицидні БУФ-15, БУФ-30- по діючої НД Петля посівна платинова, нікелева або хромникелевая Шафа сушильна – по діючої НД
Рахункова камера Тому-Цейса, Горяєва – по діючої НД Термостат сухоповітряний електричний – по діючої НД Кип'ятильник Коха – по діючої НД
Циліндри й склянки мірні – за ГОСТ 1770
Штативи для пробірок – по діючої НД
5 ТЕХНІКА БЕЗПЕКИ
5.1 Під час виробництва керуються вимогами безпеки, що встановлені
ГОСТ 12.2.003, ГОСТ 12.3.002 і НАОП 1.8.10-1.20
5.2 Повітря робочої зони повинно відповідати вимогам ГОСТ 12.1.005.
5.3 Пожежна безпека повинна відповідати вимогам ГОСТ 12.1.004.
5.4 Контроль за рівнем шуму у виробничих приміщеннях здійснюють відповідно до вимог ГОСТ 12.1.003, ГОСТ 12.1.050 і ДСН 3.3.6.037
5.5 Освітлення робочої зони повинне відповідати вимогам СНиП II-4
КД……………………… 37

6 ПЕРЕЛІК НОРМАТИВН 0-ТЕХНІЧНОЇ ДОКУМЕНТАЦІЇ

Позначення НТД

Назва НТД

1

2

ДСТУ 4221:2006

Спирт етиловий ректифікований. Технічні умови.

ГОСТ 12.1.003-83 ССБТ

Шум. Общие требования безопасности (Шум. Загальні вимоги

безпеки)

ГОСТ 12.1.004-91 ССБТ

Пожарная безопасность. Общие требования

(Пожежна безпека. Загальні вимоги)

ГОСТ 12.1.005-88 ССБТ

Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху

рабочей зоны (Загальні санітарно-гігієнічні вимоги до повітря робочої зони)

ГОСТ 12.1.050-86 ССБТ

Методы измерения шума на рабочих местах (Методи

вимірювання шуму на робочих місцях)

ГОСТ 12.2.003-91 ССБТ

Оборудование производственное. Общие требования

безопасности (Устаткування виробниче. Загальні вимоги безпеки)

ГОСТ 12.3.002-75 ССБТ

Процессы производственные. Общие требования безопасности

оцеси виробничі. Загальні вимоги безпеки)

ГОСТ 1770-74

Посуда мерная лабораторная стеклянная (Посуд мірний

лабораторний скляний. Циліндри, мензурки, колби, пробірки.

Загальні технічні умови.)

ГОСТ 4204-77

Кислота серная. Технические условия. (Кислота сірчана.

Технічні умови.)

ГОСТ 5556-81

Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия. (Вата

медична гігроскопічна. Технічні умови)

ГОСТ 5833-75

Сахароза. Технические условия (Сахароза. Технічні умови)

ГОСТ 6672-75

Стекла покровніе для микропрепаратов. Технические

условия.(Скла покривні для мікропрепаратів.

Технічні умови)

ГОСТ 9284-75

Стекла предметніе для микропрепаратов. Технические

условия.(Скла предметні для мікропрепаратів. Технічні умови)

ГОСТ 12026-76

Бум ага фильтровальная лабораторная. Технические

условия.(Папір фільтрувальна лабораторна.

Технічні умови )

ГОСТ 13191-73

Вина, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты, соки

плодово-ягодные. Метод определения этилового спирта

(Вина, виноматеріали, коньяки й коньячні спирти, соки плодово-ягідні спиртовані. Метод визначення етилового спирту )

ГОСТ 13192-73

Вина, виноматериалы и коньяки. Метод определения

сахаров (Вина, виноматеріали й коньяки.

Метод визначення цукрі)

КД……………………… 38
Продовження таблиці

1

2

ГОСТ 13193-73

Вина, виноматериалы и коньячне спирты, соки плодово-

ягодные спиртованные. Методы определения летучих кислот.(Вина, виноматеріали й коньячні спирти, соки плодово-ягідні спиртовані. Метод визначення

летучих кислот )

ГОСТ 14137-74

н

Вина, виноматериалы, коньяки и коньячне спирты. авила приемки и методы отбора проб. (Вина, оматеріали, коньяки й коньячні спирти. Правила ймання та відбору проб)

ГОСТ 14252-73

Вина и виноматериалы, соки плодово-ягодные спиртованн

тоды определения титруемых кислот. (Вина й виноматеріал соки плодово^-ягідні спиртовані. Метод визначення титруемых кислот)

ГОСТ 14351-73

Вина, виноматериалы и коньячне спирты. Метод определе

ния свободной и общей серни стой кислоты. (Вина, виноматеріали й коньячні спирти. Метод визначення вільної й загальної сірчистої кислоти )

ГОСТ 16280-2002

Агар пищевой. Технические условия.

(Агар харчової. Технічні умови)

ГОСТ 17206-96

Агар микробиологический. Технические условия.

(Агар мікробіологічний. Технічні умови)

ГОСТ 19569-89

Стерилизаторы парове медицинские. Общин тезнические

бования и методы испытаний. (Стерилізатори парові медичні. Загальні технічні вимоги й методи випробувань)

ГОСТ 22649-83

Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие

технические условия. (Стерилізатори повітряні медичні.

Загальні технічні умови)

ГОСТ 25336-82

Посуда и оборудование лабораторне стеклянные. Типы,

основне параметры и размеры. (Посуд і встаткування лабораторні скляні. Типи, основні параметри й розміри)

ГОСТ 25706-83

Лупы. Типы, основне параметры. Общин технические

требования. (Лупи. Типи, основні параметри.

Загальні технічні вимоги)

РД 202.13.027-99

Инструкция «Санитарная обработка технологического

оборудования, винопроводов, инвентаря и помещений в винодельческой промышленности. (Інструкція «Санітарна обробка технологічного встаткування, винопроводів, інвентарю й приміщень у виноробній промисловості)

ДСП 3.3.6.042-99

Державні санітарні норми мікроклімату

виробничих преміщень

КД……………………… 39

КОРОТКА ХАРАКТЕРИСТИКА МІКРОФЛОРИ ВИНОРОБНОГО ВИРОБНИЦТВА

Дріжджі (по систематиці Лоддер, 1970 р.)

ДОДАТОК А

Рід Brettanomyces

Клітини еллипсовидні, циліндричні до подовжено-довгастих, стріловидно-загострені з одного кінця. Розміри клітин (4-10) х (2-4), напівтемні.
Вегетативне розмноження почкованням. На поверхні вина більшість штамів утворять тонку, гладку, сірувато-білу плівку. Володіють високою спиртоутворююча здатністю, але в вині з об'ємною часткою спирту більше 12% їхній ріст припиняється. Ці дріжджі при бродінні утворять ефіри (головним чином оцтово-етиловий ефір), що володіють яблучним (фруктовим) ароматом, летучі й нелетучі кислоти (оцтову й лимонну кислоти), що надають вину лікарський тон у букеті та мишачий присмак, властивий ацетаміду. Продукти обміну Brettanomyces гальмують ріст і бродильні властивості культурних дріжджів, будучи причиною недоброду.
Ці дріжджі термофільні, оптимальна температура росту 32оС, несулфітостійки.

Рід Сandida (колишня назва Mycoderma)

Клітини округлі, яйцеподібні або подовжені, часто зустрічається псевдоміцелій. Форма клітин у плівці більш подовжена, великого розміру, с ліпоідними включеннями. Розміри клітин (3-12) х (2-5). Розмноження звичайно – мультіполярне почковання.
Розвиваються на поверхні вина при доступі повітря, отримуя суху й зморшкувату плівку від білого до жовтого кольору, що згодом частково обпадає на дно. Утворюють значну кількість літучих кислот і знижують зміст спирту в вині.
Розвиток дріжджів цього роду є причиною появи "цвіли" – плівки на поверхні вина, а також різкої зміни його смаку.
Продукти метаболізму дріжджів роду Candida гальмують розвиток винних дріжджів і знижують їхню бродильну здатність при вторинному бродінні; у зв'язку з малими розмірами клітин, можуть бути причиною недоброякісної фільтрації.
КД……………………… 40

Рід Hanceniaspora (колишня назва Kloeckera apiculata)

Клітини дрібніше винних, мають характерну лімоновидну (загострену з обох кінців) форму, розміри (5-8) х (2-4), напівтемні. Розмножуються у два рази швидше, ніж винні дріжджі роду Saccharomyces. Утворять псевдоміцелій.
Розмножуються біполярним почкованням. Деякі штами можуть зброжувати сусло до об'ємної частки спирту 6-7 %. Продукти їхнього метаболізму гнітять розвиток культурних дріжджів, будучи причиною недоброду сусла й підвищеного змісту летучих кислот і ефірів, що надають виноматеріалам невластивий їм аромат яблучного вина. На сусло-агарі утворять сіро-кремові гладкі, блискучі колонії.

Рід Hansenula

Клітини круглі, овальні, подовжені, почковання багатосторонє. Розміри (2-12) х (2-5).
Зустрічається щирий міцелій і псевдоміцелій. Утворить суперечки шляповидні від 1 до 4
у клітині. На поверхні вина утворюють суху матову плівку, що повзе по стінках, і згодом, що осідає на дно. Більшість штамів развиваються при вмісті об'ємної частки спирту не більше 10
%.
На щільному середовищі колонії мають біле рівне фарбування, матові. Ці дріжджі утворюють більші кількості этилацетату як в аеробних, так і в анаеробних умовах, що надає вину різкий, невластивий йому аромат. Ефективна боротьба з ними вимагає точного виконання виробничого режиму при строгому дотриманні загальних санітарно-технологічних заходів на виробництві.

Рід Pichia

Клітини від круглих до сильно витягнутих. Розміри (4-10) х (2-5) напівтемний Розмножується багатобічним почкованням. Утворює псевдоміцелій. Суперечки круглі, шляповидні. Характерною рисою є швидкий розвиток на поверхні вина, з утворенням товстої біло-жовтої зморшкуватої плівки, в основному, за рахунок окислювання спиртів і органічних кислот. Крім того, дріжджі Pichia активно розкладають гліцерин, перетворюючи його в молочну кислоту, Нітрати не асимілюють. При розвитку цих дріжджів у вині значно змінюються його смакові кількості й склад – збільшується зміст летучих кислот, слабшає фарбування, у смаку з'являються фруктово-ефірні й аптечні тони. Знижується бродильна здатність винних дріжджів.
КД……………………… 41

Рід Saccharomyces

Види, що ставляться до цього роду, не відрізняються по морфології. Клітини різноманітної форми: круглі, овальні, елліпсовидні або подовжені. Розміри (10.5-18) х (3,5 –
10,5). Розмноження почкованням. Суперечки круглі. Загальною рисою є активне зброжування цукрів і висока спиртоутворююча здатність. Види добре різняться стосовно вуглеводів. Нітрати не засвоюються.
Маючи високу активність подиху й шумування, гарною здатністю до розмноження, вони швидко стають домінуючими в шумуванні сусла, надають вину характерний букет і смак, визначають хімічний склад.

Рід Saccharomycodes

Клітини великі, подошвообразні, лімоновидні. Розміри (8-34) у довжину й до (4-9) у діаметрі. Розмножуються біполярним розподілом, що почкується. Розмноження починається по типу почковання, а кінчається по типу розподілу. Форма й розміри цих дріжджів дуже характерні, тому їх можна впевнено ідентифікувати в вині шляхом мікроскопіювання.
Зброджують і асимілюють глюкозу, сахарозу й слабко – раффинозу; асимілюють гліцерин, етиловий спирт і молочну кислоту.
Відрізняються високою сульфитостійкістю, гинуть лише при масовій концентрації сірчистого ангідриду в вині 850 мг/дм3. Утворять складні ефіри, в основному этилацетат, причому в анаеробних умовах кількість його подвоюється, з'являється неприємний кислий захід, властивий етилацетату.

Рід Zygosaccharomyces

Клітини круглі й овальні. Розміри від (2-8) х (2,5) до (5-13) х (4,5-7). Розмножуються багатобічним почкованням. Утворюють аскоспори (від 2 до 4 у сумці). Нітрати не асимілюють. Загальна біологічна особливість – здатність розвиватися в субстратах з високими масовими концентраціями цукру (до 800 г/дм3 ) – у вакуумсуслі, бекмесі й викликати їх заброжування. На відміну від інших пологів дріжджів володіють високою осмофільністю. Зброджують фруктозу й глюкозу. Можуть розвиватися й викликати заброжування вина з масовою концентрацією цукру від 20 до 50 г/дм3.

Рід Schizosaccharomyces Lindner

Дріжджі, що ставляться до роду Schizosaccharomyces, мають форму від кулястої до циліндричної, розмножуються розподілом, можуть утворювати розділені перегородками гіфи, артроспори. Аскоспори можуть формуватися на початковій стадії росту. Суперечки в асках
КД……………………… 42
мають кулясту форму або являють собою короткі еліпсоїди, рідко циліндричної форми. У процесі розмноження значна кількість клітин овальної форми, зустрічаються й кулясті. Клітини розташовуються окремо, парами, невеликими групами, утворять осад пилоподібної й пластівчастої структур, іноді утворюють на поверхні кільце. Можуть давати аскі з 2-4 кулястими або еліпсоїдальними аскоспорами. Розміри клітин (25,0-5,0(5,0-2,5) сильно варіюють не тільки від штаму до штаму, але й усередині однієї культури.
Ці дріжджі розвиваються не тільки за рахунок глюкози й сахарози, широко розповсюджених у природних субстратах, але й за рахунок обложених крохмалистих субстратів – мальтози й декстринів. Окисна здатність у дріжджів цього роду розвинена дуже слабко. Вони засвоюють джерела вуглистого харчування головним чином у процесі шумування.
Бактерії

Оцетовокислі бактерії

Аеробні мікроорганізми, що легко розвиваються у вигляді плівки на поверхні вина при доступі повітря. Форма клітин палочковидна, середні розміри (0,4-0,8) х (1,2-1,8). Звичайно одиночні або в парах, іноді з'єднані в довгі ланцюжки. Рухливі форми спостерігаються тільки в молодій культурі (24-48 годин). Чутливі до діоксиду сірки, високої кислотності та етанолу вище 12 % об. У несприятливих умовах утворять форми – клітини-гіганти, у десятки разів більше звичайних, кулясті, ковбовидні й нитковидні.
Окисляють етанол до оцтової кислоти й частина – до вуглекислого газу й води. Здатні до окислювання інших одноатомних спиртів, вуглеводів, органічних кислот (винної, яблучної, молочної, бурштинової, оцтової). Білі вина інфукуються легше, ніж червоні; молоді легше, ніж старі.
Розвитку уксуснокислих бактерій сприяє недолів ємностей, негерметичність укупорки,
висока температура зберігання.

Молочнокислі бактерії (МКБ)

Мають форму паличок або коків, розміри яких залежать від складу середовища й умов культивування. Палочковидні форми можуть бути короткими, майже коккообразні, довжиною
0,5-0,7 мкм і довгими, нитковидними, іноді сягаючої довжини 8,0 мкм. Розташовуються вони одиничне, парами або ланцюжками, деякі з характерними підрубленими кінцями.
Коккові форми молочнокислих бактерій бувають овальними, діаметр клітин від
0,5-0,6 до 1 мкм. Вони розташовуються одинично, парами або ланцюжками різної довжини, що характерно для роду Leuconostoc.
КД……………………… 43
На форму клітин значний вплив робить склад середовища. Так, у середовищах з високим змістом етилового спирту, довжина клітин молочнокислих бактерій збільшується, етиловий спирт гальмує розподіл клітин сильніше, ніж ріст. Тому в упхнутих середовищах палички витягаються в довжину, стають тонкими; коки зберігають свою форму.
Молочнокислі бактерії, що зустрічаються у виноробстві, нерухливі, не утворять суперечку, позитивно офарблюються по Граму, не утворять пігмент, не відновлюють нітрати в нітрити; є факультативними анаеробами, розвиваються у всій товщі середовища, відрізняються високою стійкістю до спирту й високої кислотності. Окремі штами роду Leuconostoc розвиваються в середовищі при рН 2,7-2,8 і етанолу до 25% об.
Зустрічаються молочнокислі бактерії у всіх типах вин і можуть викликати захворювання вина при зброжуванні цукрів . Позитивний процес – зниження кислотності – яблучно-молочне бродіння.
Процес яблучно-молочного бродіння вимагає обов'язкового контролю для встановлення його завершення, обумовленого по зникненню яблучної кислоти при хроматографичному визначенні органічних кислот у виноматеріалі та по припиненню зниження титруємої кислотності, оскільки зниження кислотності, викликане яблучно-молочним бродінням, створює сприятливі умови для розвитку менш кислотовитриманих бактерій і утилізації ними інших компонентів вина (пентоз, винної кислоти, гліцерину), що негативно впливають на якість, часто обумовлене як хвороба вина.
КД……………………… 44

Виконавці:

Зав. відділом мікробіології НІВіВ
«Магарач» С.А. Кишковська
Провідний н.с. відділу
мікробіології НІВіВ «Магарач» Н.І. Бур'ян
Ст.н.с. відділу мікробіології НІВіВ
«Магарач» Т.К. Скорікова
Ст.н.с. відділу мікробіології НІВіВ
«Магарач» О.В. Іванова
Ст.н.с. відділу мікробіології НІВіВ
«Магарач» Т.М. Танащук
Мл.н.с. відділу мікробіології НІВіВ
«Магарач» Т.В. Чорноокова

Читать фрагмент, купить и скачать в магазине электронных книг Купить  и  скачать  книгу Читать фрагмент, купить и скачать книгу fb2, epub, на андроид в магазине электронных книг ЛитРес

Читайте спиcок всех книг онлайн для бесплатного скачивания без регистрации: Рецепты домашних вин

Каталог книг по темам для бесплатного скачивания в электронных форматах

Наш сайт регулярно обновляется, и Вы можете получать новинки – электронные книги, которые на нём размещаются.
Подпишитесь на обзор книжек, и он будет приходить на Вашу электронную почту.
Вы всегда сможете легко отказаться от этой бесплатной рассылки. --> Читать последний выпуск книжной рассылки
подписаться на новые книги:
 
Я
Ищу
в возрасте от до

 
Следите за книжными новинками в Twitter
Рейтинг@Mail.ru Яндекс.Метрика +Freabooks