Проект РД Инструкция по микробиологическому контролю производства игристых вин – скачать книгу бесплатно Скачать книгу

Поиск книг на сайте  |  Каталог книг в формате pdf, djvu, fb2  |  Читайте нас вЧитайте нас в twitter!
Не нашли нужную книгу? Закажите
Подпишитесь на бесплатную рассылку новых книг

Скачать книгу Проект РД Инструкция по микробиологическому контролю производства игристых вин

Проект РД Инструкция по микробиологическому контролю производства игристых вин

Проект РД Инструкция по микробиологическому контролю производства игристых вин.


Проект РД Инструкция по микробиологическому контролю производства игристых вин

РД


РУКОВОДЯЩИЙ ДОКУМЕНТ

–--------------------------------------------------------------------------------------------------------------


Инструкция по микробиологическому РД
контролю производства игристых вин Взамен ИК 10-04-05-11-87

–--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Дата введения




1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящая инструкция предназначена для микробиологического контроля процесса приготовления игристых вин.
Инструкция содержит правила и методы микробиологического контроля чистой культуры дрожжей, виноматериалов, купажей, ликера и вспомогательных материалов, используемых при шампанизации вин и микробиологический контроль технологии бутылочного, непрерывного и периодического (акратофорного) способов приготовления игристых вин.
Инструкция предусматривает использования специальных рас дрожжей из Национальной коллекции микроорганизмов института винограда и вина "Магарач", ежегодную проверку производственной культуры дрожжей; а также, в случае применения препаратов активных сухих дрожжей- наличие заключения НИВиВ "Магарач" о соответствии их сертификату качества.
Инструкция является руководящим документом для работников заводских лабораторий.
Микробиологический контроль осуществляет микробиолог или лицо, исполняющее его обязанности. Раса дрожжей, применяемая в производстве, должна проверяться отделом микробиологии Национального института винограда и вина "Магарач" не реже одного раза в год.
В инструкции дано подробное описание основных методов исследования и микробиологического анализа, рекомендуемых для работы по контролю приготовления игристых вин.
Систематическое проведение микробиологического контроля позволяет следить за нормальным развитием чистых культур дрожжей и своевременно обнаруживать присутствие посторонней микрофлоры.
РД

2 ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ШАМПАНИЗАЦИИ ВИНОМАТЕРИАЛОВ, ГОТОВЫХ ИГРИСТЫХ ВИН И СОПУТСТВУЮЩИХ МАТЕРИАЛОВ

Микробиологический контроль ведут на всех стадиях технологии приготовления вина с целью определить микробиальное состояние контролируемых объектов, выявить очаги инфекции и вовремя сформулировать рекомендации для устранения нарушений нормального хода технологического процесса.
Микробиологический контроль ведут по рубрикам в соответствующих таблицах, где указаны предельно допустимые значения контролируемых параметров, методы контроля, а также рекомендации контроля и контролируемых показателей.

2.1 Контроль виноматериалов, поступающих на завод
Пробы из поступающих виноматериалов отбирают по ГОСТ14137-74 "Вино, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты. Правила приемки и методы отбора проб" подвергают органолептической оценке и микроскопируют (табл..2.1).

Таблица 2.1 – Экспресс-оценка микробиологического состояния виноматериалов




Виномате
риал

Количество микроорганизмов при микроскопировании


Химические
и органолептические
показатели
виноматериалов


Предвари-
тельная
оценка

В осадке после центрифу-
гирования
В виноматериале



Сумма клеток
в 5-ти полях
зрения
Сумма кле-
ток в 1 см3
Сумма
клеток
в 5-ти полях
зрения
Сумма
клеток в
1 см3


Необра-ботанный
Менее 100
Менее 5х106
Менее 5
Менее
25х104
В соответствии
с нормативно-технической
документацией

здоровый


100 и более
5х106 и
более
5 и более
25х104 и
более

В соответствии
с нормативно-технической
документацией
нестойкий

100 и более
5х106 и
более
5 и более
25х104 и
более

Массовая концентрация
летучих кислот выше до-
пустимой,* посторонний
тон во вкусе и аромате
больной
Обрабо-
танный
Менее 10
Менее
5х105
_
_
В соответствии
с нормативно-технической
документацией
здоровый

10 и более
5х105 и
более
_
_
В соответствии
с нормативно-технической
документацией
нестойкий

10 и более
5х105 и
более
_
_
Массовая концентрация
летучих кислот выше до-
пустимой,* посторонний
тон во вкусе и аромате
больной

* – при тенденции к росту массовой концентрации летучих кислот, несмотря на их допустимое начальное содержание, виноматериал считается больным
РД
2.1.1 Предварительный, ориентировочно-экспрессный способ оценки (табл.2.1) основан на определении степени обсемененности виноматериалов суммой микроорганизмов в них: дрожжами, молочнокислыми и уксуснокислыми бактериями. Общее число клеток определяется микроскопированием отобранной пробы или микроскопированием после центрифугирования (п. 3.1.3).
При микроскопировании с предварительным центрифугированием 10 см3 исследуемого материала центрифугируют при частоте вращения 25 с-1 (1,5х103 об/мин) 10 мин или при частоте вращения 50 с-1 (3,0-5,0 х103 об/мин) 5 минут. Полностью сливают надосадочную жидкость и готовят препарат для микроскопирования.
2.1.2 Для определения количества клеток микроорганизмов в 1 см3 виноматериала производят ориентировочный подсчет в пяти полях зрения микроскопа или подсчет в счетной камере ( п.3.1.4 ). Ориентировочный подсчет количества клеток ведут так. Подсчитывают количество микроорганизмов в 10 полях зрения препарата "раздавленная капля" (увеличение микроскопа – окуляр х10 или х15, объектив х40), передвигая препарат по диагонали. Затем вычисляют среднее количество клеток в пяти полях зрения. При необходимости определения количества клеток в 1 см3 расчет производят по формуле, используемой при пересчете в счетной камере ( Приложение ).
Определение систематических групп микроорганизмов проводят по морфологическому признаку при микроскопировании. (Приложение А)
2.1.3 Поскольку метод подсчета клеток не дает определения физиологического состояния микроорганизмов, то при оценке "нестойкий" и "больной" для окончательного заключения следует определить способность их к размножению ( жизнеспособность при посеве в жидкие и плотные питательные среды – п. 3.1.5 ). Контроль ведут в соответствии с таблицей 2.3.
2.1.4 Виноматериал с оценкой "нестойкий" подвергают фильтрации и сульфитации. Виноматериал, оцененный как "больной", немедленно обрабатывают по схеме: пастеризация не менее 10 мин, фильтрация, сульфитация до массовой концентрации свободной SO2
25-30 мг/дм3. Через сутки, обработанные таким образом виноматериалы, подвергаются тщательному микробиологическому контролю (табл. 2.3) и используются в производстве по заключению дегустационной комиссии.

2.2 Микробиологический контроль виноматериалов на выдержке и хранении, при составлении купажей и обескислороживания
Виноматериалы, используемые для шампанизации должны строго отвечать микробиологическим требованиям той или иной технологической операции на наличие

РД
жизнеспособных клеток микроорганизмов и присутствие посторонней микрофлоры в соответствии с показателями таблиц 2.2 и 2.3.

Таблица 2.2 – Контроль обработки и выдержки виноматериалов, обескислороживания купажей


Объект контроля
Место и периодич-
ность контроля
Предельно допустимые
значения контролиру-
емых параметров

Метод контроля
Обработанный
виноматериал на
хранении, купажи
Каждая емкость
Не реже одного раза
в месяц
Не более 5 клеток
дрожжей в 5 полях зрения.
Посторонние микроорга-
низмы не допускаются
Микроскопирование с
предварительным
центрифугированием
( пп. 3.1.3-3.1.4, табл.2.1)
Отфильтрованные
виноматериалы
Каждая емкость
после новой зарядки
фильтра и в процессе
работы
Не допускается наличие
микроорганизмов
Микроскопирование с
предварительным
центрифугированием
( пп. 3.1.3-3.1.4)
При обнаружении
микроорганизмов оцен-
ку ведут по табл. 2.3
Виноматериал для доливок
Каждая емкость перед доливкой
Не допускается наличие микроорганизмов
Микроскопирование с
предварительным
центрифугированием
( пп. 3.1.3-3.1.4)
Готовый купаж
Каждая емкость перед снятием с клея
Не допускается наличие микроорганизмов
Микроскопирование с
предварительным
центрифугированием
( пп. 3.1.3-3.1.4)
Микробиологическая оценка на биологическую стойкость
( пп.3.1.5; табл 2. 3)
Купаж на обескислорожи-
вании с дрожже-
вой разводкой

Не реже одного раза в
неделю
Смесь должна содержать 2-3 2-3 млн/см3 клеток дрожжей;
мертвых не более 5%,
посторонние микроорганиз-
мы не допускаются
Микроскопирование,
определение физиоло-
гического состояния
дрожжей (пп. 3.1.3)
Обескислорожен-
ный купаж
Не реже одного раза
в неделю
Допускается наличие 3-5 нежизнеспособных клеток дрожжей. Молочнокислые
бактерии не допускаются
Микроскопирование с
предварительным
центрифугированием
( пп. 3.1.4-3.1.5)
Окрашивание препарата
(3.1.3)


2.2.1 При обнаружении микроорганизмов в препаратах обработанного ассамбляжа и купажа необходима повторная фильтрация или перезарядка фильтра.
2.2.2 Для доливки резервуаров используют вино микробиологически чистое и не моложе доливаемого.


РД
2.2.3 Ассамбляжи, готовые купажи, в том числе и обескислороженные купажи, находящиеся на выдержке и хранении, при наличии в центрифугированном осадке клеток микроорганизмов обязательно оцениваются на способность к размножению при высеве пробы на питательные среды (пп. 3.1.3-3.1.5 ) и анализируются в соответствии с табл. 2.3.

Таблица 2.3 – Оценка устойчивости виноматериалов при всех видах технологических
обработок и хранении к микробиологическим помутнениям
( определение жизнеспособности, дифференциация культур)




Оценка
состояния
образцов
Время развития микроорганизмов, сутки


Рост в пробирках с виноматериалом, вином
Рост молочнокислых
бактерий при посеве на
питательную среду

дрожжей
уксуснокислых бактерий
или смеси уксуснокис-
лых бактерий и дрожжей

с сорбиновой
кислотой


с этанолом


винных
посторонних
("диких",
пленчатых)



Больной

1 сутки при
наличии
пленки

1-2

3

3
Нестойкий
1-3
1-3
3-5
4-6
4-15
Стойкий
4 и более
4 и более
6 и более
7 и более
более 15

Примечание: развитие молочнокислых бактерий при анализе высококислотных виноматериалов и вин, снижение в них концентрации титруемых кислот свидетельствуют о прохождении яблочно-молочного брожения.

2.2.4 Устойчивость виноматериалов и вин к микробиологическим помутнениям определяют по времени развития микроорганизмов (сутки) в отобранной пробе при высеве в питательные среды (табл. 2.3).
Для определения присутствия в отобранной пробе винных дрожжей, уксуснокислых бактерий и посторонней дрожжевой флоры (пленчатые дрожжи) – 10 см3 пробы наливают в стерильную пробирку с ватной пробкой или другую какую-либо стерильную емкость и помещают в термостат при температуре (26+1) о С. Рост микроорганизмов определяется визуально (пленка, помутнение) и микроскопированием.
Виноматериалы и вина, инфицированные молочнокислыми бактериями, выявляют по времени развития их после посева на элективные питательные среды. Исследуемую пробу в количестве 0,5 мл высевают в одну из питательных сред для молочнокислых бактерий (с добавлением сорбиновой кислоты или этанола). В качестве питательных сред используют солодовое сусло, яблочно-солодовое сусло, разбавленное виноградное сусло, капустную среду (п.4.2.1). Элективные условия для молочнокислых бактерий создают добавлением в среду непосредственно перед посевом этилового спирта с объемной долей 14 % (0,95 см3 на 5 см3 среды). Можно использовать также сочетание действия сорбиновой кислоты, подавляющей рост дрожжей, с созданием
РД
анаэробных условий для предотвращения роста уксуснокислых бактерий (агаровые пробки). Используют сорбат натрия с массовой концентрацией 5 г/100 см3 из расчета 0,2 см3 на 10 см3 вина.
2.2.5 Больным или нестойким считается виноматериал или вино, в котором обнаружен рост за определенное число суток хотя бы одного из указанных в табл. 2.3 микроорганизмов (дрожжей, бактерий). Косвенным показателем больного вина является массовая концентрация летучих кислот, превышающая допустимую, а также посторонние тона при органолептической оценке.
2.2.6 Виноматериал, оцененный как "больной", "нестойкий", обрабатывают по схеме, указанной в "Инструкции по стабилизации виноградных вин".
2.2.7 Виноматериалы с высокой титруемой кислотностью и наличием молочнокислых бактерий проверяют методом бумажной хроматографии на наличие яблочной кислоты (п. 3.2.1). При обнаружении яблочной кислоты решается вопрос об оставлении виноматериалов для отдельных типов вин для окончания яблочно-молочного брожения или предотвращения этого процесса (например, пастеризацией).
Виноматериал, в котором проходит биологическое кислотопонижение, подвергают микробиологическому и химическому контролю не реже 1 раза в 10 дней по ГОСТ 13192, 14252, 14351, 13192.
О начале яблочно-молочного брожения свидетельствует резкое увеличение количества бактерий, снижение концентрации титруемых кислот, повышение концентрации летучих кислот. В зависимости от температуры и SO2 в вине завершается этот процесс в течение 20 суток и более. Окончание процесса яблочно-молочного брожения судят по уменьшению пятен яблочной кислоты на хроматограмме. По окончании процесса инактивируют бактерии ( сульфитация до массовой концентрации 30-50 мг/дм3 свободной SO2, пастеризация), затем проводят оклейку, фильтрацию.

2.3 Контроль приготовления разводки чистой культуры дрожжей

2.3.1 На всех стадиях приготовления разводки чистой культуры дрожжей обязательным является строгое соблюдение правил санитарии и осуществление микробиологического контроля.
2.3.3 Для приготовления производственной разводки дрожжей первые генерации разводки готовят в заводской лаборатории. Сущность способа заключается в постепенном увеличении массы дрожжей при 15 оС путем последовательных пересевов на все большее количество питательной среды – 5 генераций. Последнюю генерацию обычно ведут в резервуарах с перемешивающим устройством и используют для приготовления производственных разводок в дрожжерастильных аппаратах способом, принятым на заводе.
РД 00334830.037 – 2003
Таблица 2.4 – Микробиологический контроль приготовления разводки
чистой культуры дрожжей

Объект контроля
Место и периодичность
контроля
Предельно допустимые
значения контролируемых
параметров

Метод контроля
Разводка чистой
культуры дрож-
жей в заводской
лаборатории
Последняя генерация
разводки
В разводке при наличии 95%
физиологически активных
клеток допускается 3-5%
мертвых.
Начальная концентрация
клеток для загрузки разводки
в дрожжерастильный
аппарат должна быть не
менее 10 млн/см3 .
Микроскопирование,
окрашивание препа-
ратов (3.1.2-3.1.3)
Питательная
среда для дрож-
жерастильных
аппаратов
После пастеризации
и фильтрации для
каждой дрожжевой
разводки
Не допускается присутствие
микроорганизмов
Микроскопирование
центрифугированной
пробы (3.1.3)
Дрожжевая раз-
водка, отпускае-
мая производству

Дрожжерастильный
аппарат,
ежедневно
Разводка должна содержать
Не менее80 млн клеток в 1 см3
Почкующихся 30-40%;
мертвых не более 5%
Наличие посторонних
микроорганизмов не
допускается
Микроскопирование,
Окрашивание препа-
ратов, подсчет клеток
(3.1.2-3.1.4)
Воздух, подава-
емый в дрож-
жанку через обеспложиваю-
щий фильтр
После фильтра
2 раза в месяц
Не более 5 колоний микроорганизмов на
плотной питательной
среде
Посев на плотную
питательную среду (3.3)

2.3.3 Разводку дрожжей готовят на стерильной среде с объемной долей этилового спирта 10-11% , массовой концентрацией сахара 5-8 г/100 см3 и массовой концентрацией титруемых кислот 7-8 г/дм3 (купаж, прошедший технологическую обработку).
Питательную среду в заводской лаборатории для первых генераций нагревают до температуры 85-90 оС и выдерживают при этой температуре 15 минут.
Питательную среду для приготовления производственной разводки пастеризуют при температуре 70-75 оС или подвергают обеспложивающей фильтрации.
2.3.4 Производственная разводка чистой культуры дрожжей к моменту введения в тиражную смесь должна быть в стадии активного брожения, содержать в пределах 80 млн/см3 клеток с минимальным числом мертвых, однородных по форме и размерам, во взвешенном состоянии при пылевидной структуре осадка и в небольших скоплениях при зернистой или хлопьевидной структуре осадка.
2.3.5 Для характеристики физиологического состояния клеток дрожжей определяют:
–количество почкующихся клеток;
–процент соотношения живых и мертвых клеток (окраска метиленовым голубым);
–содержание гликогена (окраска раствором Люголя).
РД
В цикле развития дрожжей определяют следующие стадии:
– размножение – большое количество почкующихся клеток с однородной цитоплазмой и тонкой оболочкой. Почкующейся клеткой считается та, у которой дочерняя клетка значительно меньше материнской.
– брожение – дрожжи находятся в виде отдельных клеток. Цитоплазма зернистая, мелкие вакуоли, имеется запас питательных веществ.
– отмирание – отставание цитоплазмы от клеточной стенки. Отмершие клетки кажутся сильно деформированными.
– автолиз – клетки кажутся пустыми, утолщается оболочка, иногда разрывается; в вине появляется помутнение.
При медленном развитии дрожжей рекомендуется в питательную среду вводить источники азота, например: аммиак (24%-ный раствор в количестве 2-3 мл/дал).
2.3.6 При замене жидких разводок дрожжей на препараты активных сухих дрожжей (АСД) проводится их проверка на наличие живых активных клеток дрожжей и посторонней микрофлоры. Их реактивация проводится согласно рекомендации производителя.
Препараты АСД хорошего качества содержат 15-30(109 и более живых клеток в 1 г препарата, не содержат посторонней дрожжевой и бактериальной микрофлоры.
Количество вносимых в бродильную (тиражную) смесь дрожжей и их физиологическое состояние должны соответствовать требованиям табл. 2.6.
2.4 Микробиологический контроль приготовления ликеров (тиражного, резервуарного, экспедиционного) и вспомогательных виноматериалов

2.4.1 Объектами микробиологического контроля являются вода, оклеивающие вещества, танин, сахароза, лимонная кислота, двуокись углерода (газообразная).
2.4.2 Поступающую на завод воду анализируют один раз в месяц. Анализ воды проводит санитарно-эпидемиологическая служба.
2.4.3 Контроль чистоты воздуха, производственных помещений и двуокиси углерода проводят 1 раз в месяц.
2.4.4 Сахар и лимонная кислота, используемые при приготовлении ликеров могут быть загрязнены волокнами ткани упаковочного материала, другими посторонними включениями, следовательно, поступающие на завод партии этих материалов проверяют согласно ГОСТ 5833, 2219.
2.4.5 Лимонная кислота, применяемая для подкисления ликера, должна быть сухой, чистой, без посторонних примесей. Контроль чистоты лимонной кислоты ограничивается визуальным осмотром поступающей на завод партии.
РД
Таблица 2.5 – Требования и микробиологическая оценка материалов
при изготовлении ликеров

Объект контроля
Место и периодичность
контроля
Предельно допустимые
значения контролиру-
емых параметров

Метод контроля

Виноматериал
Каждая партия
перед приготовлением
ликера
Не допускается нали-
чие микроорганизмов
Микроскопирование с
предварительным
центрифугированием
(3.1.3)
Сахар-песок
Каждая партия при
приемке в производство

Не допускается нали-
чие микроорганизмов
и механических
включений
Подготовка пробы,
посев на плотную
питательную среду,
микроскопирование
(3.1.2-3.1.5)
Ликер
Каждая партия за
4-5 суток до использования
в производстве
Не допускается наличие
Микроорганизмов
Посев на плотную
питательную среду,
микроскопирование
(3.1.2-3.1.5; 4.2.5)

2.4.6 Присутствие микроорганизмов и посторонних включений в ликерах не допускается.
2.4.7 Каждую партию оклеивающих веществ, Танина и лимонной кислоты проверяют при поступлении в производство. Они не должны содержать микроорганизмов, способных развиваться в винах и механических включений.
2.5 Микробиологический контроль шампанизации виноматериалов
2.5.1 Бутылочный способ
Таблица 2.6 – Контроль процесса производства игристых вин бутылочным способом

Объект контроля
Место и
периодичность
контроля
Предельно допустимые
значения контролируемых
параметров

Метод контроля
Тиражная смесь
Каждая партия
непосредственно
перед розливом
в бутылки
Не менее 1 млн.клеток/см3 ,
мертвых клеток дрожжей
не более 5%, посторонние микроорганизмы не допускаются
Микроскопирование,
окрашивание, подсчет
количества клеток в 1 см3
(3.1.2-3.1.4)
Брожение в
бутылках
Каждая однородная
Партия по бутам через
каждые 10 сут
до окончания
брожения
Мертвых клеток дрожжей
не более 7%,посторонние микроорганизмы не допускаются
Микроскопирование,
окрашивание (3.1.2-3.1.4)
Кюве в процессе
послетиражной
выдержки
Каждая
партия
при перекладке,
ремюаже
Оценивается физиологическое
состояние дрожжей; посторон-
ние микроорганизмы не допус-
каются, наблюдается структура
осадка в бутылке
Микроскопирование,
структура осадка оцени-
вается визуально
(3.1.2-3.1.4)
Готовая продук-
ция после
дегоржажа
Выборочно из
каждой партии
Вино не должно содержать
каких-либо клеток микроорга-
низмов и механических
частиц
Микроскопирование
осадка центрифугирован-
ной пробы; оценка
устойчивости вина к
микробиальным помут-
нениям (3.1.2-3.1.5; 3.2.2)
Контрольная
выдержка
Каждая партия

Визуальная оценка при
просмотре бутылок

РД

2.5.1.1 При загрузке резервуаров или розливе тиражного резервуара необходимо предварительно проверить чистоту коммуникаций, оборудования, тары.
2.5.1.2 Если при хорошем размешивании тиражной смеси в поле зрения микроскопа содержится менее 3-х живых клеток дрожжей, то процесс брожения может задержаться, следовательно количество дрожжей надо увеличить.
2.5.1.3 Активность дрожжей в тиражной смеси проверяют посевом 0,5 см3 тиражной смеси в пробирку с 4,5 см3 стерильного тиражного вина с массовой концентрацией сахара 10 г/100см3 и выдержкой при 25 оС. Образование дрожжевого осадка в посевах через 2-3 суток свидетельствует об активном состоянии дрожжей.
2.5.1.4 При перекладках кюве в процессе послетиражной выдержки микробиологический контроль предусматривает наблюдение за изменением структуры осадка, его однородности в верхних и нижних бутылках уложенного штабеля, за физиологическим состоянием дрожжей и наличием посторонней микрофлоры в осадках.
При отклонении от нормального течения ремюажа микробиолог проверяет качество осадков и устанавливает причины.
2.5.1.5 Если установили, что брожение приостановилось, необходимо выяснить причину. Рекомендуется проверить количество SO2 в вине, а также выяснить, были ли резкие смены температуры, сквозняки и т.п. При нормальных условиях жизнедеятельности дрожжей и состава вина следует провести перекладку со взбалтыванием и создать благоприятные температурные условия.
2.5.1.6 Для полной характеристики дегоржируемой партии шампанского определяют характер масок и составляющие их элементы выборочным микроскопированием осадка и налета на внутренней поверхности бутылки (микроскопирование при малом увеличении отколотого кусочка стекла).
2.5.1.7 Качество фильтрации экспедиционного ликера проверяют перед дозированием в бутылки.
2.5.1.8 Шампанское, используемое для дозировки, подвергают микробиологическому контролю.
2.5.1.9 Готовую продукцию подвергают микробиологическому контролю путем микроскопирования центрифугированной пробы и посева вина на плотную питательную среду, а также испытанию на микробиальную стойкость вина (табл. 2.2).
В отдельных бутылках с шампанским (не более 2 из 10 бутылок) допускается наличие не более 2-х мертвых клеток микроорганизмов и белковых частиц.
РД
2.5.2 Резервуарный периодический способ
Таблица 2.7 – Контроль производства игристых вин резервуарным
периодическим способом
Объект контроля
место и
периодичность
контроля
Предельно допустимые
значения контролируемых
параметров
Порядковый номер
метода контроля
Бродильная
смесь в акрато-
форах
Каждый
резервуар
После перемешивания концен-
трация клеток дрожжей должна
быть 2-4 млн/см3 с долей
жизнеспособных 95%.
Посторонних микроорганизмов
не должно быть
Микроскопирование,
окрашивание, под-
счет количества
(3.1.2-3.1.4)
Процесс
вторичного
брожения
Каждый резервуар
не реже 1 раза
в неделю
На 3-4 сут. (начало забражи-
вания) не менее 50 %
почкующихся клеток.
На 7-16 сут. – не менее 20 %
почкующихся клеток, мертвых
не более 10%
Микроскопирование,
окрашивание, под-
счет количества
(3.1.2-3.1.4)
Шампанизиро-
ванное вино

Перед розливом
При микроскопировании
микроорганизмы отсутствуют
Микроскопирование
центрифугированной
пробы (3.1.2-3.1.3)

2.5.2.1 При обнаружении даже одной дрожжевой клетки в препарате следует взять вторую пробу. Если данные подтвердятся, необходимо перезарядить фильтр. 2.5.2.2 Допускается очередное проведение процесса шампанизации на дрожжах, оставляемых в акратофоре от предыдущего брожения, в случае положительного заключения микробиолога об их качестве и чистоте.
2.5.2.3 Стадии процесса (вторичного) брожения в акратофорах характеризуются определенным давлением CO2 : 7-16 сутки – до 0,25 МПа; 17-24 сутки – до 0,40 МПа.
2.5.3 Непрерывный способ
2.5.3.1 При обнаружении в осадке центрифугированной пробы микроорганизмов в купаже после термообработки рекомендуется произвести посев пробы на плотную питательную среду для уточнения жизнеспособности микроорганизмов в соответствии с табл. 2.3. При наличии живой инфицирующей микрофлоры необходимо провести санитарную обработку и перезарядку оборудования.
2.5.3.2 В процессе шампанизации вина в потоке рекомендуется контролировать физиологическое состояние дрожжей во взвеси и в осадке. Если дрожжи во взвеси живые, но в угнетенном состоянии, не почкуются, то возможной причиной является недостаток азотного питания. В таком случае рекомендуется азотная подпитка путем введения раствора аммиака и аммонийных солей.
2.5.3.3 Шампанизированное вино в приемных аппаратах перед розливом рекомендуется периодически проверять на микробиологическую стойкость путем посевов в жидкие и на плотные питательные среды ( табл.2.2).
РД
Таблица 2.8 – Контроль игристых вин при непрерывном способе шампанизации

Объект
контроля
место и
периодичность
контроля
Предельно допустимые
значения контролируемых
параметров

Метод контроля
Купаж для
шампанизации
после термооб-
работки
1 раз в месяц
Не допускается присутствие
жизнеспособных
микроорганизмов
Микроскопирование
осадка центрифуги-
рованной пробы с
предварительным ок-
рашиванием препарата
(3.1.2-3.1.4)
Купаж с ликером
Передаточный
резервуар,
2 раза в месяц
Не допускается присутствие
жизнеспособных микроор-
ганизмов
Микроскопирование
осадка центрифуги-
рованной пробы с
предварительным ок-
рашиванием препарата
(3.1.2-3.1.4)
Бродильная смесь
перед подачей
на шампанизацию
Каждая емкость
1 раз в неделю
Концентрация клеток дрожжей
в смеси 3-5 млн/см3 с долей
жизнеспособных – 95%
Посторонние микроорганизмы
не допускаются
Микроскопирование,
окрашивание препа-
рата; подсчет клеток
дрожжей
(3.1.2-3.1.4)
Процесс
шампанизации
вина
Не реже 1 раза
в две недели
Не допускается наличие
посторонней микрофлоры.
Общее количество клеток
дрожжей с долей почкующих-
ся и мертвых должно соот-
ветствовать стадии непрерыв-
ного брожения
Микроскопирование,
Подсчет клеток
дрожжей и определение
физиологического
состояния
(3.1.2-3.1.4)
Шампанизиро-
ванное вино на
выходе из уста-
новки
Не реже 1 раза
в неделю
Не должно содержать живых клеток дрожжей и посторонней
микрофлоры
Микроскопирование
центрифугированной
пробы, окрашивание
препарата
(3.1.2-3.1.4)
Охлажденное
шампанизиро-
ванное вино
Из аппарата для
обработки холодом
2 раза в год
Присутствие микроорганизмов (бактерий и дрожжей) не
допускается
Микроскопирование
осадка центрифуги-
рованной пробы
(3.1.2)
Шампанизиро-
ванное вино в
приемных
аппаратах
Приемный аппарат
перед розливом
Присутствие любого вида
и рода микроорганизмов
исключается
Микроскопирование
осадка центрифуги-
рованной пробы
(3.1.2)



2.6 Контроль розлива игристых вин в бутылки

2.6.1 Шампанское, поступающее с фильтра на розлив, подвергают микробиологическому анализу в течение всего времени розлива. Важным является качество вымытых бутылок и отобранных пробок
2.6.2 Качество мойки бутылок, приготовленных для налива, контролируют путем наружного осмотра и микроскопирования смывной воды.
2.6.3 Пробки, отобранные для укупорки бутылок с вином, должны быть без постороннего запаха, механических частиц и микроорганизмов.
РД
Таблица 2.9 – Микробиологический контроль бутылок и пробок

Объект
контроля
место и
периодичность
контроля
Предельно допустимые
значения контролируемых
параметров

Метод контроля
Пробки
Склад, цех розлива
при приемке;
1 раз в смену при
подаче на розлив;
1 раз в месяц в про-
цессе хранения
Смывная вода должна быть
прозрачной и бесцветной,
наличие микроорганизмов
не допускается
Микроскопирование с
предварительным
центрифугированием
смывной воды (3 проб-
ки обмывают в 50 см3
стерильной воды)
(3.1.2-3.1.4)
Бутылки
Цех розлива,
перед подачей на
розлив,
1 раз в смену
Смывная вода должна быть
прозрачной и бесцветной,
наличие микроорганизмов
не допускается
Микроскопирование с
предварительным
центрифугированием
смывной воды (внут-
реннюю поверхность
2 бутылок обмывают
в 50 см3 стерильной
воды)
(3.1.2-3.1.4)

2.6.4 Качество фильтрации каждой партии шампанского с разливной машины контролируют непрерывно, пока микробиолог не удостоверится в хорошей фильтрации, которая характеризуется отсутствием клеток микроорганизмов в осадке центрифугированной пробы.
При обнаружении даже одной клетки в 5 полях зрения микроскопа обязательно берут повторную пробу. Если при повторном контроле в препарате обнаруживают клетки микроорганизмов, розлив останавливают для перезарядки фильтра.
2.6.5 Перед поступлением готовой продукции на внешнее оформление, отобранные образцы от каждой партии подвергают микробиологическому контролю путем микроскопирования центрифугированной пробы, а также испытанию на микробиологическую стойкость (табл. 2.3).

2.7 Контроль готовой продукции
2.7.1 Заключение о состоянии шампанского каждого тиража или резервуара дается на основании предварительно полученных данных лабораторного контроля при розливе или дегоржаже. Поэтому микробиологический контроль при выдержке шампанского проводится лишь по указанию главного шампаниста.
2.7.2 В случае помутнения шампанского или образования в нем осадка, а также при возврате из торговой сети, микробиолог определяет характер помутнения прямым микроскопированием после центрифугирования.
2.7.3 Каждая помутневшая партия шампанского просматривается для определения внешнего вида мутного вина с осадком. Если вид осадка однороден, берут бутылку, осторожно открывают ее, и часть вина сливают. Остаток тщательно перемешивают, отбирают пробу и центрифугируют. После этого осадок микроскопируют и определяют его характер.
2.8 Контроль вспомогательных материалов
2.8.1 Объектами микробиологического контроля являются вода, оклеивающие вещества, танин, фильтрпластины, фильтрующие материалы, пробки, сахар, лимонная кислота и др. Контроль производится в случае необходимости при поступлении на завод.
2.8.2 Поступающая на завод вода подвергается контролю 1 раз в месяц. Анализ воды проводит санитарно-эпидемиологическая служба.
2.8.3 О чистоте вспомогательных материалов судят по внешнему осмотру (на присутствие механических загрязнений и постороннего запаха) или по отсутствию в ополосках смывной воды микроорганизмов, вредных для винодельческого производства, обнаруживаемых микроскопированием и дающих рост на соответствующих средах.
2.8.4 Контроль оклеивающих веществ может быть ограничен микроскопированием объекта при поступлении его в производство. Для этого в 1 г сухого клея (желатина), взятого стерильно из средне отобранной пробы, вносят 10 см3 стерильной воды. После тщательного пятиминутного взбалтывания часть пробы центрифугируют и просматривают под микроскопом.
2.8.5 Проверка фильтрпластин осуществляется при микроскопировании вина каждый раз при зарядке фильтра, после пропускания первых порций вина и достижения его полной прозрачности. В случае обнаружения микроорганизмов или механических примесей необходимо проверить сборку фильтра и устранить дефекты.
2.8.6 Контроль сахара и лимонной кислоты описан в разделе 2.4.
2.8.7 Контроль чистоты воздуха производственных помещений проводят 1 раз в месяц
(п. 3.3) по ГОСТ 12.1.005, 17.2.3.01.
2.9 Контроль санитарного состояния помещений, технологического оборудования и резервуаров
Таблица 2.10 – Микробиологический контроль оборудования и технологической тары

Объект
контроля
Место и
периодичность
контроля
Предельно допустимые
значения контролируемых
параметров

Метод контроля
Оборудование,
предназначенное
для проведения
технологических
операций
Каждый узел тех-
нологической
схемы после мой-
ки и обработки
При микроскопировании допус-
кается наличие 1-2 мертвых
клеток микроорганизмов или спор
плесневых грибов не в каждом поле
зрения
Микроскопирование
мазка, взятого с по-
верхности площадью
10х10 см2 , окрашива-
ние (3.1.2-3.1.4)
Резервуары,
бочки, буты,
акратофоры и др.
каждая единица
технологической
тары после каждой
мойки и обра-
ботки
Смывная вода должна быть
прозрачной и бесцветной, при
микроскопировании до 1-2
мертвых клеток дрожжей или
спор плесневых грибов не в
каждом поле зрения
микроскопирование с
предварительным
центрифугированием
последней смывной
воды контролируемого
объекта, окрашивание
(3.1.2-3.1.4)



РД
2.9.1 Производственные помещения контролируют один раз в неделю по внешним признакам путем осмотра поверхности резервуаров, стен, потолков, полов.
2.9.2 Порядок проведения санитарной обработки технологического оборудования, винопроводов, инвентаря и помещений в винодельческой промышленности устанавливается РД 202.13.027-99.

3 ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

3.1 Методы микробиологического контроля

3.1.1 Отбор и подготовка проб к анализу
Отбирают среднюю пробу от однородной партии виноматериала по правилам, предусмотренным ГОСТ 14137.
Если виноматериал долгое время оставался в состоянии покоя, пробы необходимо отбирать из различных слоев, в том числе и из осадка. Для этого пользуются предварительно обработанными спиртом резиновыми шлангами или пробоотборниками, которые после каждого отбора пробы следует промыть чистой водой, а затем исследуемым виноматериалом. После отбора проб из инфицированных виноматериалов шланги и пробоотборники необходимо ополаскивать водой, затем спиртом и пользоваться ими повторно не ранее, чем через 5 мин.
В случае невозможности отбора пробы через верхнее отверстие емкости пробу можно отбирать из нижнего крана. Поверхность закрытого крана обрабатывают спиртом или обжигают пламенем спиртовки (факела). Перед отбором пробы сливают 5-10 см3 виноматериала, в зависимости от наличия застойных зон в месте отбора пробы.
При оценке микробиологического состояния виноматериала методом посева на питательные среды пробу берут с соблюдением правил стерильности.
Пробу отбирают в стерильную посуду (пробирки, колбы). Перед взятием образца посуду освобождают от ватной пробки, обжигают горловину, наполняют и, перед тем, как закрыть, снова обжигают горловину и пробку. Наполняют колбу не более чем на 1/3 объема, чтобы случайно не смачивалась пробка при взбалтывании. Перед центрифугированием, микроскопированием или посевом отобранную пробу тщательно перемешивают.
Микробиологический анализ проб рекомендуется проводить немедленно после отбора, но не позднее, чем через 2 ч при условии хранения образцов в холодильнике при температуре
(6+1) оС, а при контроле количественного состава микрофлоры – не позднее, чем через 20 мин.
Микробиологическое исследование проводят путем микроскопирования, а при необходимости более углубленного анализа пробы проводят посевы на жидкие или плотные питательные среды.
РД
3.1.2 Техника микроскопирования.
Светлопольная микроскопия. Наиболее распространены и удобны в заводских микробиологических лабораториях биологические оптические, светлопольные микроскопы с окулярами (7, (10, (15, (20 и объективами (10, (20, (40, (90 с наибольшим увеличением 1350 раза (определяется увеличение произведением увеличения объектива на увеличение окуляра).
Светлопольные микроскопы позволяют исследовать объекты в проходящем свете. После установки света на столик микроскопа ставят предметное стекло (препарат) и при помощи макровинта опускают тубус до тех пор, пока объектив не коснется покровного стекла. Затем постепенно поднимают тубус до появления изображения. Дальнейшую фокусировку производят микрометрическим винтом. При работе с иммерсионным объективом на препарат наносят каплю
РД 00334830.037 – 2003
иммерсионного масла и объектив (90 опускают в масло до соприкосновения со стеклом (при работе с водноиммерсионным объективом на предметное стекло наносят каплю воды). Медленно поднимают тубус, находят изображение.
Светлопольную микроскопию используют при подсчете числа клеток, ориентировочного определения систематических групп микроорганизмов, для изучения морфологии клеток в неокрашенных и окрашенных специальными красителями препаратах , а также для проверки чистоты анализируемой пробы. Рассматривают препарат при увеличении микроскопа 15(40, 20(40.
Люминесцентная микроскопия. Принцип люминесцентной микроскопии основан на способности микроорганизмов светиться под влиянием падающего на них света. Люминесценцию можно наблюдать с помощью обычного микроскопа, установив на пути яркого источника света светофильтр, пропускающий сине-фиолетовые лучи, вызывающие люминесценцию частей препарата, способных светиться. Синий свет, возбуждающий эту люминесценцию, значительно ярче ее самой; поэтому, чтобы поле зрения не засвечивалось, используют дополнительный желтый светофильтр. Для микроскопических исследований выпускаются специальные люминесцентные микроскопы.
Препараты микроорганизмов можно обработать специальными красителями – флуорохромами, получив вторичную флуоресценцию, т.е. способность клеток или отдельных органелл ярко светиться.
Люминесцентная микроскопия применяется для выявления живых и мертвых клеток микроорганизмов, изучения их строения. Флуорохром свободно проникает внутрь клетки, придавая клеточным органеллам характерное свечение. Наиболее пригодными для прижизненной обработки микроорганизмов являются следующие флуорохромы:
РД
– примулин, с помощью которого различают живые и мертвые клетки (у живых клеток светится только оболочка, мертвые ярко светятся);
– акридиновый оранжевый, связываясь с белками протоплазмы, придает им темно-зеленое свечение;
– аурофосфин аккумулируется митохондриями, ярко светящимися золотистым светом.
3.1.3 Приготовление препаратов для микроскопирования
Для препаратов применяют предметные стекла размером 76(26 мм, толщиной (1,2(0,2) мм, предметные стекла размером 18(18 мм или 24(24 мм и толщиной (0,16(0,01) мм. Новые предметные стекла для работы (в неспецифических бактериальных лабораториях) достаточно промыть в горячем мыльном растворе, затем водопроводной водой и тщательно – дистиллированной водой. Стекла, бывшие в употреблении, ополаскивают теплой водой, моют в мыльном растворе, тщательно промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой. Стекла сушат в сушильном шкафу и хранят в сосуде с крышкой или плотно завернутыми в бумагу. Покровные стекла хранят в бюксах с этиловым спиртом объемной долей 95%.
Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препарата берут бактериологической петлей или стерильными пипетками. Бактериологические петли делают из кусочка проволоки (платиновой, нихромовой) длиной 6-7 см и диаметром 2-4 мм, которую закрепляют в металлическом держателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки огибают на кончике карандаша или пипетки, формируя плотно замкнутую петлю, Стерилизуют петлю в пламени спиртовки или газовой горелки.
Микроорганизмы можно наблюдать как в неокрашенном виде, так и с прижизненной окраской.
Препарат для наблюдения в раздавленной капле используют для установления формы клеток микроорганизмов, их размеров, структуры, подвижности, характера размножения, а также для изучения основных групп микроорганизмов производства вин (см. Приложение).
При микроскопировании с предварительным центрифугированием 10 см3 исследуемого материала центрифугируют при частоте вращения 25 с-1 (1,5х103 об/мин) 5 мин. Сливают надосадочную жидкость и из осадка готовят препарат "раздавленная капля".
На чистое обезжиренное предметное стекло стерильной петлей помещают каплю исследуемого материала (субстрат, суспензия, взвесь) и накрывают предметным стеклом. При опускании предметного стекла на каплю, следует прикоснуться его ребром к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить. Иногда под стеклом остаются пузырьки воздуха, Если они единичные, то они не мешают микроскопированию и ими можно воспользоваться при отыскании мелких микроорганизмов в поле зрения микроскопа. Если пузырьков воздуха много, то препарат следует переделать. Капля должна быть небольшой, чтобы жидкость не выступала за края покровного
РД
стекла. Излишек жидкости, вышедший из-под покровного стекла, удаляют полосками фильтровальной бумаги.
При микроскопировании культуры с плотной питательной среды на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильной водопроводной воды.
Для окраски препаратов используют мало концентрированные растворы различных красок, которые не оказывают на клетки губительного действия, дифференциально окрашивают содержимое клетки и способствуют более точному изучению формы и клеточных структур.
Живые и мертвые клетки дрожжей и бактерий определяют при окрашивании нейтральной красной или метиленовой синей концентрации от 0,001 до 0,0001%. Небольшую каплю красителя вводят под покровное стекло или микроорганизмы вносят в каплю краски на предметном стекле и накрывают предметным стеклом. Живые клетки не окрашиваются, а мертвые – окрашиваются в цвет красителя. Волютин в вакуолях клеток дрожжей выпадает в виде ярко окрашенных синих или красных шариков.
Приготовление мителенового синего. Растворяют 3 г краски в 100 см3 этилового спирта с объемной долей 96%. Через 2-3 дня из него готовят разбавленные водные растворы в отношении 1:10, 1:40, 1:300.
Гликоген в клетках окрашивается йодом в красно-бурых цвет. Используют для прижизненного окрашивания раствор Люголя (0,33 г йода кристаллического и 0,66 г йодистого калия растворяют в 100 мл дистиллированной воды).
3.1.4 Методы определения общего числа клеток микроорганизмов.
Для определения концентрации (числа клеток) микроорганизмов в 1 мл жидкости производят подсчет их под микроскопом в счетной камере (Тома-Цейса, Горяева и др.).
Счетные камеры имеют вид толстого предметного стекла, в центре которого находится стеклянная пластинка с выгравированной на ней сеткой (или две сетки на разделенной пополам пластинке). Справа и слева от центральной пластинки находятся две другие пластинки, уровень которых на 0,1 мм выше. При увеличении микроскопа 15х40 в поле зрения микроскопа помещается один большой квадрат счетной камеры, состоящей из 16 маленьких квадратов или не разделенный на маленькие квадраты.
После тщательного перемешивания исследуемую жидкость берут сухой стеклянной палочкой или петлей, наносят на сетку счетной камеры, накрывают специальным шлифованным покровным стеклом толщиной 0,25-0,35 мм и притирают его до появления радужных колец на боковых частях.
Подсчитывают все клетки микроорганизмов, находящиеся внутри большого квадрата, а также клетки на пограничных линиях, если большая их часть находится в данном квадрате. Клетки,
РД
большая часть которых находится в другом квадрате, не подсчитывают. Если клетки пересекаются пограничной линией пополам, то их считают только на двух смежных сторонах квадрата, например, на левой и нижней. В каждом препарате подсчитывают клетки в пяти больших квадратах, например, по углам и в центре сетки. Слишком густые суспензии следует разбавлять водой в таком соотношении, при котором количество клеток в одном большом квадрате будет не более 30. Для достоверности результата подсчета необходимо сделать не менее 3-4 препаратов. Расчет числа микроорганизмов в 1 см3 исследуемого субстрата проводят по формуле
М=а х 50000 х n, ( 1 )
где М – количество клеток микроорганизмов в 1 см3 суспензии;
а – сумма клеток микроорганизмов в пяти больших квадратах (средняя величина);
n – кратное разведение исходной суспензии микроорганизмов;
50000 – коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на 1 см3
Для подсчета общего количества клеток дрожжей, образующих конгломераты, рекомендуется в исследуемую пробу добавлять равное количество серной кислоты с массовой долей 10% и тщательно ее перемешивать для разъединения скопления клеток. Подсчитывая результаты, следует учитывать двукратную степень разбавления серной кислотой.
При дифференцированном подсчете почкующихся, живых и мертвых клеток дрожжей на сетку помещают каплю исследуемой дрожжевой суспензии, добавляют каплю водного раствора красителей нейтрального красного или метиленового голубого с массовой концентрацией 0,01 г/100 см3, перемешивают, покрывают покровным стеклом, притирают его. Подсчитывают отдельно количество почкующихся, живых и мертвых клеток, учитывая при этом двукратную степень разбавления раствором красителя. Полученные данные выражают в млн.клеток в 1 см3 или в процентах к общему количеству.
Ориентировочный подсчет количества клеток. Для определения общей обсемененности объекта подсчитывают количество микроорганизмов в 10 полях зрения препарата "раздавленная капля", передвигая препарат по диагонали. Затем вычисляют среднее количество клеток в одном поле зрения. При необходимости определения количества клеток в 1 см3 расчет производят по формуле, используемой при подсчете в счетной камере.
При отдельном подсчете в суспензии клеток, живых и мертвых, в окрашенных препаратах "раздавленная капля" также учитывают двукратную степень разбавления красителем и полученные данные выражают в млн.клеток в 1 см3 или в процентах к общему количеству.
Количественный учет жизнеспособности микроорганизмов на плотных средах. Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную питательную среду в чашки Петри и последующем подсчете числа выросших колоний. При этом принимают, что каждая колония образуется при размножении одной клетки (дрожжей,
РД
молочнокислых и уксуснокислых бактерий). Этот метод позволяет вести учет только жизнеспособных клеток микроорганизмов.
При большом обсеменении микроорганизмами проб (образца), для посева их разбавляют, готовят разведенные суспензии. Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце, и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в субстрате. При анализе берут стерильно 1 см3 пробы и помещают в 9 см3 стерильной водопроводной воды или физиологического раствора. Затем последовательно новой пипеткой переносят по 1 см3 в ряд пробирок с 9 см3 стерильной водопроводной воды, каждый раз используя новую стерильную пипетку.
Из полученных разведений, предварительно тщательно перемешанных, производят высев на поверхность агаровой пластинки в чашки Петри. Посев производят стерильными пипетками,
обычно по 0,05; 0,1; 0,2 см3 , начиная с наибольшего разведения, при этом может применяться для посева одна стерильная пипетка. Объем внесенной суспензии распределяют по поверхности среды стерильным шпателем, при этом также для другой чашки Петри берут новый стерильный шпатель. Засеянные чашки Петри помещают в термостат при температуре (26 +1) оС , благоприятной для развития учитываемых микроорганизмов.
Подсчет выросших колоний проводят через 3-5 суток. Считают колонии, не открывая чашки Петри, повернув их кверху дном. Для счета берут те чашки, на которой колонии хорошо отделены одна от другой. Каждую отсчитанную колонию помечают точкой с нижней стороны чашки Петри чернилами или маркером. При большом количестве колоний дно чашки делят на сектора, подсчитывают колонии в каждом секторе и результаты суммируют.
Лучшим разведением считается то, при высеве которого на плотной питательной среде вырастает от 50 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасывают. Желательно, чтобы общее количество подсчитанных колоний при высеве из данного разведения было не менее 300.
Зная количество выросших колоний и степень разведения, определяют количество микроорганизмов в 1 см3 исследуемого образца. По морфологии выросших колоний (при просмотре в лупу) можно судить не только о численности микроорганизмов, но и об их разнообразии в исследуемом образце.
3.1.5 Определение жизнеспособности культур микроорганизмов. Жизнеспособность микрофлоры отобранных проб образцов вина определяют по росту в жидких и на плотных питательных средах (табл. 1.3).При росте в жидких средах микроорганизмы вызывают помутнение, образуют осадок, кольцо или разного характера пленки. О физиологическом состоянии микроорганизмов судят по скорости
РД
появления видимого роста, а о групповой принадлежности – по характеру роста, виду колоний и данных микроскопирования. Пленчатые дрожжи и уксуснокислые бактерии дают характерные пленки на поверхности жидкой среды. Молочнокислые бактерии растут во всей толще жидкой среды с образованием шелковистых муаровых волн при встряхивании (см. рекомендуемые питательные среды для роста культур и дифференциации дрожжей, уксуснокислых и молочнокислых бактерий – п. 3.2.1).
Метод мембранной фильтрации. Метод основан на выделении дрожжей и других микроорганизмов из исследуемого вина с помощью фильтрации через мембранный фильтр с определенным размером пор. Данный метод позволяет исследовать относительно большие объемы продукта, а также выделять и учитывать минимальные количества микроорганизмов,
содержащихся в нем. Это достигается удерживанием клеток на поверхности мембран и последующим их выращиванием.
Значительное преимущество состоит в том, что этим методом можно отделять микроорганизмы от их метаболитов и ингибиторов, содержащихся в фильтруемом вине или другом субстрате, пропуская через фильтр стерильную воду после фильтрации продукта. При этом исключается ингибирование культур и создаются лучшие условия для их выращивания на селективных средах и последующей идентификации.
Для проведения анализа используют фильтровальную установку, например из нержавеющей стали, с сосудом для фильтрата и насосом. Перед каждым употреблением фильтровальная установка должна быть простерилизована в автоклаве или обработана спиртовым раствором с объемной долей спирта 70%. Мембранный фильтр с помощью обожженного в пламени горелки пинцета помещают в гнездо прибора.
Стерильные мембранные фильтры изготавливают из нитратов целлюлозы. На поверхность фильтров, как правило, наносится сетка с размером квадрата 3,1(3,1 мм, что облегчает подсчет выросших колоний. Для лучшего распознавания и подсчета выросших колоний
Фильтры окрашены; например фильтры, используемые для дрожжевых культур, черного цвета. Фильтры находятся в индивидуальной упаковке, предотвращающей их инфицирование и обеспечивающей их стерильность в течение длительного времени.
Горлышко бутылки тщательно обрабатывают, и ее содержимое отфильтровывают. При этом присутствующие в продукте микроорганизмы задерживаются на фильтре за счет ситового эффекта. Затем для удаления веществ, ингибирующих рост микроорганизмов, через фильтр пропускают небольшое количество стерильной воды или физиологического раствора.
В стерильную чашку Петри заливают 3,0-3,5 см3 стерильной дистиллированной воды и с помощью стерильного пинцета туда помещают картонный диск, пропитанный питательной
РД
средой. По окончании фильтрации стерильным пинцетом укладывают мембранный фильтр в чашку Петри, распределяя на поверхности картонного диска. Чашку Петри термостатируют, следя за развитием микроорганизмов. Поступление питательных веществ с картонного диска к развивающимся микроорганизмам и отвод продуктов метаболизма происходит через поры мембранного фильтра. По окончании выращивания исследуют культуры под микроскопом и подсчитывают количество колоний, пересчитывая его на объем профильтрованного продукта.
С помощью мембранной фильтрации можно количественно определять различные группы микроорганизмов. Для этого используют мембранные фильры с соответствующим размером пор, а также картонные диски, пропитанные растворами селективных сред. Для удобства применения картонные диски, равномерно пропитанные высушенным питательным субстратом, находятся в стерильных чашках Петри. К ним прилагается соответствующий мембранный фильтр.
При отсутствии готовых питательных сред можно использовать приготовленные в лаборатории стерильные, разлитые в чашки Петри среды, помещая на их поверхность мембранные фильтры.
3.2 Контроль процесса яблочно-молочного брожения
Осуществляется путем контроля концентрации титруемых кислот и состава основных органических кислот ( винной, яблочной и молочной).
3.2.1 Метод бумажной хроматографии
Позволяет определить качественный состав основных органических кислот.
Контролируют процесс хроматографическим методом определения в виноматериалах винной, яблочной и молочной кислот.
Реактивы.
Растворитель. Готовят смесь, в состав которой входят (в объемных долях) н-бутиловый спирт –40%; муравьиная кислота массовой концентрации 85% – 10%; вода – 50%. Смесь взбалтывают в делительной воронке или колбе в течение 10-15 мин и оставляют в воронке на сутки для расслаивания. Верхний слой используют для хроматографирования. Работу проводят в вытяжном шкафу.
Проявитель. Бромфеноловый синий массовой концентрации 0,5 г/дм3 в спирте-ректификате. На каждые 250 см3 проявителя добавляют раствор NaOH молярной концентрации 0,1 моль/дм3 для доведения величины рН до 8,0.
Для приготовления свидетелей (чистых растворов кислот – винной, яблочной) растворяют по 30 мг кислоты в 5 см3 спирта-ректификата.
Для приготовления раствора молочной кислоты растворяют 1-2 капли молочной кислоты массовой концентрации 50 г/100 см3 в 5 см3 спирта-ректификата.
РД
Материалы и посуда.
Бумага хроматографическая, эксикатор диаметром 20 см и более, капилляры для нанесения капель.
Техника проведения анализа.
Из хроматографической бумаги вырезают круг по диаметру эксикатора, в центре описывают окружность диаметром 2,0 см, на которой отмечают точки на расстоянии 1,5 см одна от другой.
Положив круг на ровную стеклянную поверхность, вино и растворы свидетелей набирают в микропипетки или капилляры и каплями наносят в отмеченные точки. Размер пятна на бумаге должен быть не более 3 мм. Каждую последующую каплю наносят после высыхания предыдущей. Растворы свидетелей наносят в каждую точку 5-6 раз, исследуемое вино – 6-8 раз.
После высушивания (вентилятором, феном) в центр круга вставляют фитилек, который делают из полоски хроматографической бумаги шириной 1 см и высотой чуть больше высоты чашки Петри.
Чашку Петри с растворителем помещают в эксикатор. Свободный конец фитилька, вставленного в круг, опускают в растворитель. Эксикатор герметически закрывают крышкой и устанавливают на строго горизонтальную поверхность в помещении с температурой (18-20) оС в вытяжном шкафу.
Когда растворитель пройдет по радиусу расстояние 7-8 см от центра, разделение считают законченным. Обычно это происходит за 60-90 мин. Растворитель можно использовать повторно. Бумажный круг извлекают, высушивают в вытяжном шкафу до исчезновения запаха муравьиной кислоты и опрыскивают раствором проявителя из пульверизатора.
Кислоты –свидетели располагаются по радиусу в следующем порядке: винная, яблочная, молочная. Для идентификации пятен кислот отмеряют расстояние по радиусу от точки нанесения капли до начала пятна. Сравнивают это расстояние с расстоянием, пройденным соответствующим свидетелем. Идентичные кислоты проходят одинаковое расстояние.
Контроль яблочно-молочного брожения этим методом сводится к наблюдению за скоростью утилизации яблочной кислоты молочнокислыми бактериями (исчезновение пятна яблочной кислоты на круговой хроматограмме и увеличение пятна молочной кислоты). Полное исчезновение яблочной кислоты свидетельствует о необходимости срочной обработки виноматериала с целью инактивации бактерий и их удаления.
3.2.2 Метод контроля развития молочнокислых бактерий в жидкой среде под парафиновой пробкой.
Колбы вместимостью 100 или 200 см3 с длинной калиброванной шейкой заполняют засеянной питательной средой или исследуемым вином до метки и закрывают (заливают) толстым слоем
РД
слегка подогретой смеси, состоящей на 2/3 из парафина и на 1/3 из парафинового масла. Колбы ставят в термостат при (26(1)о С. Такое приспособление позволяет наблюдать пузырек углекислого газа, образующийся под парафиновой пробкой и определять его объем.
Исследуемые пробы предварительно освобождают от углекислого газа путем взбалтывания под вакуумом. Для предупреждения развития дрожжей в вино вводят сорбиновую кислоту.
Исчезновение яблочной кислоты и снижение концентрации титруемых кислот следует подтвердить аналитически, так как образование углекислого газа даже без участия дрожжей нельзя рассматривать как специфическое явление яблочно-молочного брожения.
3.3 Микробиологический контроль воздуха.
Микробиологическое исследование воздуха проводят седиментационным методом, основанным на оседании микробных клеток на плотной питательной среде в открытой чашке Петри. Для этого в стерильные чашки Петри разливают агаризованную среду – солодовое сусло, мясо-пептонный агар (МПА). После затвердевания среды, завернутые в стерильную бумагу чашки Петри переносят в цех для исследования. В зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения воздуха чашку выдерживают 5, 10, 15 мин открытой, а затем ставят в термостат на 3-5 сут при (26(1) оС и подсчитывают выросшие колонии.
Установлено, что в течение 5 мин на чашку площадью 100 см2 оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 дм3 воздуха.
Исходя из этого, подсчитывают количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха по формуле
Х = А х 5 х100 х100 / S х К; (2)
Где Х – число микроорганизмов в воздухе, млн клеток/м3
100 – число для пересчета площади чашки, см2;
100 – число для пересчета 10 дм3 воздуха в 1 м3;
А – количество выросших колоний на чашке Петри;
S – площадь чашки, см2
К – временный коэффициент, если чашка открыта 5 мин –1; 10 мин – 2; 15 мин – 3;

Этот метод не дает точных количественных показателей загрязненности воздуха, но при одинаковых условиях анализа можно получить сравнительные данные. Для контроля проводить анализ воздуха во дворе завода (в летнее время-после поливки двора). Количество микроорганизмов в воздухе производственных помещений не должно превышать количество микроорганизмов в наружном атмосферном воздухе.
При анализе воздуха, поступающего в дрожжевые аппараты, не всегда имеется возможность внести чашку Петри в воздуховод с обеспложенным воздухом, в этом случае используют колбу типа промывалки. На дно колбы наливают 10-12 см3 агаризированной питательной среды и вместе с резиновой трубкой, закрытой ватной пробкой, стерилизуют в автоклаве. После застывания
РД
питательной среды колбу через резиновую трубку присоединяют к воздуховоду. Воздух пропускают через колбу в течение 2 час, после чего колбу закрывают ватной пробкой и помещают в термостат на 3-5 сут при (26+1) оС.
Качество очистки воздуха, подаваемого в дрожжевые аппараты, можно также промерить путем его барботирования (пропускания) в течение 2 часов через колбу со стерильной водопроводной водой и последующим посевом 1 см3 пробы воды на агаризированную среду. Улавливание клеток микроорганизмов проводят, подсоединяя колбу к обводной линии воздуховода после фильтра. Таким же методом анализируют и двуокись углерода газообразную, но время пропускания газа ограничивается 20 мин.

4 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О РАБОТЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
4.1 Подготовка лаборатории
Микробиологические работы проводят в специально оборудованном помещении с изолированным входом. Если микробиологические работы ведутся в общей комнате технологического контроля, то выделяют площадь 6-8 м2 для бокса, в котором производят все работы с посевами в стерильные среды. Бокс отгораживают деревянными перегородками, остекленными на высоте 80 см от пола . Стол в боксе устанавливают на кронштейнах и покрывают линолеумом или пластиком.
Дезинфекцию проводят дезинфицирующими препаратами, например, 5%-ным раствором хлорамина. Рекомендуется также протирать поверхность стола ватным тампоном, смоченным раствором этилового спирта с объемной долей спирта 70 %. Перед началом работы бокс
облучают бактерицидной лампой БУВ-15 или БУВ-30 в течение 30 мин. (пребывание людей в помещении с включенной бактерицидной лампой запрещается).
Стол для микроскопирования в лаборатории располагают перед окнами на северной стороне. В солнечные дни окна в помещении завешивают белыми шторами для защиты от прямых солнечных лучей, утомляющих глаза при микроскопировании и губительно действующих на микроорганизмы.
Для проведения микробиологического контроля в микробиологической лаборатории должно быть необходимое оборудование, посуда, вспомогательные материалы и др.
4.1.1 Мойка посуды.
Новую стеклянную посуду, пробирки, колбы, склянки, чашки Петри и др. по ГОСТ 1717 промывают и погружают на ночь в 1-2%-ный раствор соляной или серной кислоты, затем тщательно прополаскивают водой и высушивают.

РД
Посуду, бывшую в употреблении, моют в проточной теплой воде ершами с использованием кальцинированной соды, полужидкого мыла, мыльного раствора и синтетических моющих средств. После тщательно ополаскивают водопроводной, а затем дистиллированной водой. Сильно загрязненную посуду со следами жира обрабатывают хромовой смесью (хромпиком).
Вымытую посуду сушат при комнатной температуре в специальных корзинах или в сушильном шкафу при температуре 100-105 оС. Чисто вымытую и высушенную посуду, закрытую ватными пробками с бумажными колпачками или без них, хранят в местах, защищенных от пыли, в шкафах. Предметные и покровные стекла для приготовления препаратов должны быть совершенно чистыми и обезжиренными. Для тонких микробиологических работ новые и бывшие в
употреблении стекла тщательно моют смесью серной кислоты с двухромовокислым калием, водой, содовым раствором и др. Для повседневной работы достаточно тщательно промыть стекла в мыльной дистиллированной воде, обмыть чистой водой и вытереть насухо чистой салфеткой. Для обезжиривания чисто вымытые и сухие стекла протирают чистой ваткой, смоченной в эфире, или обжигают поверхность на пламени горелки (жир при этом сгорает).
Промытые стекла хранят сухими, сложенными в пакеты (дезинфекция стекол в нашей области исследований не требуется), или в спирте в банке с притертой пробкой для особых случаев микроскопирования. На поверхности чистого стекла вода легко расплывается, не образует капель.
4.1.2 Стерилизация посуды
Для стерилизации микробиологическую посуду завертывают в бумагу полностью или частично для сохранения стерильности после прогревания.
При подготовке пипеток к стерилизации в концы, которые берут в рот, вставляют ватные тампоны. Пастеровские пипетки завертывают в бумагу по 3-15 штук. Градуированные пипетки завертывают в длинные полоски бумаги шириной 4-5 см. Обмотку начинают с конца, который опускают в среду. Пипетку обертывают по спирали и заканчивают у конца, который берут в рот. Конец бумаги закручивают или приклеивают. Пипетки можно завертывать в лист бумаги по 3-5 штук. На бумаге надписывают объем завернутых пипеток и дату стерилизации. При наличии пеналов пипетки стерилизуют в них.
Пробирки перед стерилизацией закрывают ватными пробками. Для стерилизации готовят пакеты пробирок, завернутых в бумагу, или ставят пробирки в специальную корзину.
Для изготовления пробок лучше использовать гигроскопическую вату, так как она не так сильно тлеет. Пробка должна легко входить в пробирку и при вынимании из нее не терять своей формы. Длина пробки для обычной пробирки около 4 см. В пробирку пробка должна входить на 1,5-2,0 см. Удобно для работы обертывать пробку чистой марлевой салфеткой.

РД
Ватные пробки делают из пласта ваты по ГОСТ 5556, скручивая его руками на столе или на пинцете, или на специальном аппарате.
4.1.3 Стерилизация питательных сред
Жидкие и плотные питательные среды, содержащие сахара, стерилизуют в кипятильнике Коха ежедневно по 20 мин. в течение 3-х дней, либо в автоклаве (ГОСТ 19569) под давлением не выше 0,05 МПа (112о С) в течение 20 мин.
Таблица 4.1 – Методы стерилизации
Предмет
Подготовка к стерилизации
Режим и способ стерилизации
1
2
3
Держатели фильтров, смонти-
рованные на колбах
Упаковать в оберточную
бумагу
В автоклаве:
при 121о С – 15 мин
при 128о С – 10 мин
при 134о С – 3 мин
Детали к приборам, резиновые
пробки, шланги
Упаковать в оберточную
бумагу
То же
Пипетки мелкие и
предметные стекла
Уложить в цилиндры
В сушильном шкафу
при 160о С в течение 2 ч
Петли и иглы для посевов
культур, мелкие металлические
инструменты
_
Прокаливание в пламени
горелки перед прокаливанием
Пипетки
Единичные – упаковать в
бумагу; большое количество –
уложить в специальные
пеналы с крышками
В сушильном шкафу
при 160о С – 2 ч
при 170о С – 1 ч
Пробирки
Закрыть ватными пробками,
завернуть в бумагу по 10-20,
40 шт.
В сушильном шкафу
при 160о С – 2 ч
при 170о С – 1 ч
Пустые стеклянные бутыли,
закрытые винтообразными
колпачками с резиновыми
прокладками
Уложить в проволочные
корзины
В автоклаве
при 121о С 20 мин
Стеклянные флаконы, склянки,
колбы, бутыли
Единичные – закрыть ватными
пробками с бумажными
колпачками; мелкие уложить
в проволочные корзины
В сушильном шкафу
при 160о С – 2 ч
при 170о С – 1 ч
Чашки Петри
Упаковать в оберточную
бумагу каждую отдельно или
по 5-10 шт, можно стерилизо-
вать в специальных этажерках
В сушильном шкафу
при 160о С – 2 ч
при 170о С – 1 ч
РД 00334830.037 – 2003
Продолжение таблицы 4.1
1
2
3
Чистые центрифужные
пробирки, изготовленные из
термолабильных материалов

Ультрафиолетовым облучении-
ем (доза 5 мкб/см2 ) с
последующим хранением
пробирок в стерильных сосудах
Шпатели Дригальского
Завернуть в бумагу по одному
или несколько (до 5 шт.)
В сушильном шкафу
при 160о С – 2 ч
при 170о С – 1 ч

Среды, не содержащие сахаров, стерилизуют в автоклаве при давлении 0,1 МПа (121о С) в течение 20 мин.
Хранят питательные среды в прохладном, защищенном от света и не слишком влажном помещении.
Для стерилизации питательных сред, которые изменяют свои свойства при нагревании, можно использовать холодную стерилизацию, заключающуюся в фильтровании через обеспложивающие микропористые фильтры, устройство и материал которых обеспечивают задержку микроорганизмов (асбестовые фильтры Зейтца, керамические, порошковые, прессованные или мембранные фильтры).

4.2 Приготовление питательных сред
4.2.1 Универсальные питательные среды.
Солодовое сусло. Неохмеленное пивное сусло фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Определяют массовую долю сухих веществ, которая обычно составляет 15-18%. Водопроводной водой разводят сусло до массовой доли сухих веществ, которая обычно составляет для выращивания дрожжей – 6-8%; для молочнокислых бактерий – 2-5% при рН 5,0-6,0. При более низком рН сусло подщелачивают 10%-ным раствором NaHCO3 или гидроксида калия. Среду фильтруют до блеска. Уплотняют среду добавлением 2%-ного агара по ГОСТ 17206.
Среда предназначена для выращивания дрожжей, молочнокислых и уксуснокислых бактерий.
Автолизат дрожжей. Готовят из прессованных хлебопекарных дрожжей или отмытых осадочных винных дрожжей. Для приготовления среды автолизат разбавляют водой в соотношении 1:10 с добавлением сахара из расчета массовой концентрации 10-20 г/дм3 . Питательная среда предназначена для культивирования дрожжей и молочнокислых бактерий.
Вино с сахаром. Готовят из белого сухого вина или обработанного купажа виноматериалов с добавлением вакуум-сусла, сахарозы или глюкозы до массовой концентрации сахара в среде от 20 до 50 г/дм3 и подвергают пастеризации.
РД
Среда предназначена для культивирования дрожжей, уксуснокислых и молочнокислых бактерий.
Дрожжевая вода. 70-100 г свежих прессованных или 7-10 г сухих дрожжей размешивают
в 1 дм3 дистиллированной воды и кипятят 30 мин. После отстаивания на холоде в высоком цилиндре в течение 12 ч жидкость декантируют и фильтруют. К фильтрату добавляют 1 дм3 воды и еще раз кипятят 30 мин и вновь фильтруют. Для лучшей прозрачности можно прибавить до кипячения взбитый с водой яичный белок. рН среды доводят до нужного значения раствором кислоты и стерилизуют при температуре (121+1)о С в течение 30 мин.
Среда используется для выращивания дрожжей и молочнокислых бактерий.
Яблочное сусло. В свежий или консервированный яблочный сок добавляют при необходимости сахар до массовой концентрации 10-12 г/100 см3 . Массовая концентрация титруемых кислот не должна превышать 6-7 г/дм3. При излишней кислотности сок разбавляют водой. Стерилизуют текучим паром 15-20 мин.
Среда используется для культивирования дрожжей и молочнокислых бактерий
Капустная среда . 200 г измельченной капусты в 1 дм воды кипятят в течение10-12 мин, отжимают, фильтруют, в 2 раза разводят водой и добавляют глюкозу до массовой концентрации 2 г/100 см3 , пептон до массовой концентрации 1 г/100 см3.
Можно использовать сухую капусту, высушенную в тени при температуре до 35о С и притоке свежего воздуха. Для приготовления среды берут 6-8 г сухой капусты и кипятят в 1 л воды. Разливают в пробирки высоким слоем (по 8-10 мл). Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин или в автоклаве при 121о С в течение 30 мин.
Среда предназначена для накопления и выделения молочнокислых бактерий.
Смесь солодового сусла с яблочным. В состав среды входят: солодовое сусло с массовой концентрацией сухих веществ 5 г/100 см3- 1/2 объема и яблочное сусло – 1/2 объема. Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.
Среда предназначена для культивирования молочнокислых бактерий.
Среда для выделения дрожжей-бреттаномицетов Для выделения дрожжей типа Brettanomyces / Dekkera используют среду следующего состав: бактериологический пептон-2%; дрожжевой экстракт –1% ; глюкоза – 1,5 %; мел- 2 %; агар-агар –2 %
Дифференциально-диагностическая среда с индикатором. Для раздельного определения уксуснокислых и молочнокислых бактерий служит жидкая или плотная питательная среда, состоящая из дрожжевой воды, с добавлением 10%-ного дрожжевого автолизата ( рН 7), и с добавлением смешанного индикатора (бромкрезол красный и бромкрезол зеленый – 1:1).

РД
Молочнокислые бактерии образуют молочную и уксусную кислоты, в результате чего реакция среды становится кислой и цвет индикатора меняется от синего через желто-зеленый до желтого. При развитии уксуснокислых бактерий образуется аммиак, который подщелачивает среду и изменяет ее цвет из синего в фиолетовый.
Для подавления роста плесеней, которые интенсивно растут на сусле и сусло-агаре, рекомендуется добавлять этиловый спирт, доведя его концентрацию до объемной доли 4% или 0,2% –ный раствор пропионовокислого натрия.
Среда АТБ (среда Гарви). Среда состоит из пептона массовой концентрации 10 г/дм3 ; дрожжевого экстракта массовой концентрации 5 г/дм3; 250 см3 томатного сока; MnSO4 . 4H2O массовой концентрации 0,05 г/ дм3 ; MgSO4 . 7 H2O массовой концентрации 0,2 г/ дм3 и раствора глюкозы массовой концентрации 10 г/ дм3 , рН среды доводят до 4,8. Стерилизуют среду текучим паром 3 дня подряд по 30 мин или в автоклаве при 112о С в течение 20 мин.
Среда предназначается для культивирования молочнокислых бактерий рода Leuconostoc.
4.2.2 Питательные среды для культивирования уксуснокислых бактерий.
Вино с суслом . В состав среды входят по 1/3 объема столового сухого вина, виноградного сусла и водопроводной воды. Пастеризуют среду при 80о С в течение 15 мин.
Элективная среда с антибиотиками. В питательной среде, содержащей 20 ед/см3 мономицина при высеве пробы исследуемого вина развиваются уксуснокислые бактерии. В присутствии этого антибиотика молочнокислые бактерии не размножаются.
4.2.3 Плотные питательные среды.
Готовят на основе жидких добавлением агара до массовой концентраци 1,5 – 2,0 г/100 см3. Среда лучше уплотняется и не отстает от стекла при хранении, если добавить 10% желатина. Стерилизуют среды при температуре (121 ( 1)о С в течение 30 мин. В чашки Петри разливают в горячем виде из расчета 15-20 см3 на чашку.
Если рН среды ниже 5,0 (виноградное сусло, яблочно-солодовое сусло), то агар готовят отдельно, так как при стерилизации в кислой среде агар гидролизуется. При этом массовая концентрация водного агара должна быть 3-4 г/100 см3 в расчете на его разбавление средой. Агар стерилизуют при температуре (121 ( 1)о С. Перед розливом расплавленный водный агар смешивают с равным количеством горячей питательной среды и полученную смесь в теплом виде разливают на чашки Петри или пробирки. Приготовленные таким образом чашки используют только после полного застывания питательной среды.
Для получения скошенного агара в пробирках, их заполняют расплавленной средой на 1/3 высоты пробирки и стерилизуют. Перед посевом скашивают, предварительно расплавив.
РД
4.2.6 Физиологический раствор.
0,85 г хлористого натрия растворяют в 100 см3 дистиллированной воды и стерилизуют при (121( 1)о С в течение 20 мин.
4.2.7 Допускается применение элективных сред отечественного и зарубежного производства.

4.3 Средства контроля и вспомогательных устройств
Автоклав медицинский ВК-75 – по ГОСТ 19569
Агар-агар – по ГОСТ 16280
Бумага фильтровальная – по ГОСТ 12026
Бумага хроматографическая – по действующей НД
Вата гигроскопическая – по ГОСТ 5556
Воронки Бюхнера – по ГОСТ 9147
Воронки стеклянные 4, 6, 8, 10 и 15 см 53 0 – по ГОСТ 25336
Капельницы – по ГОСТ 25336
Кислота серная – по ГОСТ 4204
Колбы конические – по ГОСТ 25336
Колбы круглодонные – по ГОСТ 25336
Лупа – по ГОСТ 25706
Микроскоп световой биологический – по действующей НД
Пипетки градуированные – 1,2,5,10 см 53 0 – по ГОСТ 29227
Пипетки Мора – 5,10,15,25,50,100 см 53 0 и без расширения –1,2 см 53 0- по ГОСТ 25336
Палочки стеклянные – по ГОСТ 25336
Пептон – по ГОСТ 13805
Потенциометр (рН-метр лабораторный) – по ГОСТ 9245
Пробирки биологические, без ранта – по ГОСТ 25336
Пробирки центрифужные 10 см3 – по ГОСТ 25336
Спиртовки стеклянные или металлические – по ГОСТ 25336
Стекла предметные размером 26 ( 76 мм, толщиной 1,1-1,4 мм по ГОСТ 9284
Стекла покровные размером 14(14 или 18(18, толщиной 0,15-17мм – по ГОСТ 6672
Спирт технический (для спиртовок) – по ГОСТ 18300
Спирт-ректификат этиловый – по ГОСТ 5962
Центрифуги лабораторные – по действующей НД
Чашки Петри диаметром 100 мм, высотой 15 мм – по ГОСТ 25336-82Е
Эксикатор – по ГОСТ 25336-82Е
РД
Ерши для мойки пробирок, колб – по действующей НД
Карандаши для стекла – по действующей НД
Лампы бактерицидные БУФ-15, БУФ-30- по действующей НД
Петля посевная платиновая, никелевая или хромникелевая
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-250 – по ТУ 64-1-909
Счетная камера Тома-Цейса, Горяева – по действующей НД
Термостат суховоздушный электрический ТС-80-М-2 – по ТУ 64-1-1382
Кипятильник Коха – по действующей НД
Цилиндры и стаканы мерные – 50,100 и 500 см 53 0 – по ГОСТ 1770
Штативы для пробирок – по действующей НД

5 ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ
5.1 Основные требования к работе в лаборатории описаны в "Правилах техники безопасности и производственной санитарии в винодельческой промышленности", М., 1982, п.12,
ГОСТ 12.1.004, ДСП 3.3.6.042.
5.2 При поступлении на работу микробиолог должен обязательно пройти инструктаж по технике безопасности.
5.3 При работе с автоклавом должна строго соблюдаться инструкция по эксплуатации автоклава и "Правила устройства и безопасности эксплуатации сосудов, работающих под давлением"

6 ПЕРЕЧЕНЬ НОРМАТИВН0-ТЕХНИЧЕСКОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ

Обозначение НТД
Название НТД
1
2
ДСТУ 2213-93
Сахар-рафинад
ДСТУ 4221200-3
Спирт этиловый ректификованный. Технические условия.
ГОСТ 12.1.004-91
Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 ССБТ
Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху
рабочей зоны
ГОСТ 17.2.3.01-86
Охрана природы. Атмосфера. Правила контроля воздуха
населенных пунктов
ГОСТ 1770-74
Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры,
мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия.
Продолжение таблицы

1
2
ГОСТ 4204-77
Кислота серная. Технические условия.
ГОСТ 5556-81
Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия.
ГОСТ 5556-81
Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия.
ГОСТ 5833-75
Сахароза. Технические условия.
ГОСТ 6672-75
Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия.
ГОСТ 9284-75
Стекла предметные для микропрепаратов.
Технические условия.
ГОСТ 12026-76
Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 13191-73
Вина, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты,
соки плодово-ягодные спиртованные. Метод определения
этилового спирта
ГОСТ 13192-73
Вина, виноматериалы и коньяки. Метод определения сахаров
ГОСТ 13193-73
Вина, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты,
соки плодово-ягодные спиртованные. Метод определения
летучих кислот
ГОСТ 14137-74
Вина, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты.
Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 14252-73
Вина и виноматериалы, соки плодово-ягодные
спиртованные. Метод определения титруемых
кислот.
ГОСТ 14351-73
Вина, виноматериалы и коньячные спирты. Метод
определения свободной и общей сернистой кислоты
ГОСТ 16280-88
Агар пищевой. Технические условия.
ГОСТ 17206-96
Агар микробиологический. Технические условия.
ГОСТ 19569-89
Стерилизаторы паровые медицинские. Общие
технические требования и методы испытаний.
ГОСТ 22649-83
Стерилизаторы воздушные медицинские.
Общие технические условия.
ГОСТ 25336-82
Посуда и оборудование лабораторные стеклянные.
Типы, основные параметры и размеры.
ГОСТ 25706-83
Лупы. Типы, основные параметры.
Общие технические требования.
РД 202.13.027-99
Инструкция "Санитарная обработка технологичес-
кого оборудования, винопроводов, инвентаря и
помещений в винодельческой промышленности.
ДСП 3.3.6.042-99
Державні санітарні норми мікроклімату
виробничих преміщень




РД
ПРИЛОЖЕНИЕ А
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОФЛОРЫ
ВИНОДЕЛЬЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

Дрожжи (по систематике Лоддер, 1970 г.)
Род Brettanomyces / Dekkera
Клетки эллипсовидные, цилиндрические до удлиненно-продолговатых, стреловидно-заостренные с одного конца. Размеры клеток (4-10) х (2-4) мкм.
Вегетативное размножение почкованием. На поверхности вина большинство штаммов образуют тонкую, гладкую, серовато-белую пленку. Обладают высокой спиртообразующей способностью, но в вине с объемной долей спирта более 12% их рост прекращается. Эти дрожжи при брожении образуют эфиры (главным образом уксусно-этиловый эфир), обладающие яблочным (фруктовым) ароматом, летучие и нелетучие кислоты (уксусную и лимонную кислоты), придающие вину лекарственный тон в букете и мышиный привкус, свойственный ацетамиду. Продукты обмена Brettanomyces тормозят рост и бродильные свойства культурных дрожжей, являясь причиной недоброда.
Эти дрожжи термофильны, оптимальная температура роста 32оС, несульфитоустойчивы.
Род Сandida (прежнее название Mycoderma)
Клетки округлые, яйцевидные или удлиненные, часто встречается псевдомицелий. Форма клеток в пленке более удлиненная, большого размера. с липоидными включениями. Размеры клеток (3-12) х (2-5) мкм. Размножение обычно – мультиполярное почкование.
Развиваются на поверхности вина при доступе воздуха, образуя сухую и морщинистую пленку от белого до желтого цвета, со временем частично опадающую на дно. Образуют значительное количество летучих кислот и снижают содержание спирта в вине.
Развитие дрожжей этого рода является причиной появления "цвели" – пленки на поверхности вина, а также резкого изменения его вкуса.
Продукты метаболизма дрожжей рода Candida тормозят развитие винных дрожжей и снижают их бродильную способность при вторичном брожении; в связи с малыми размерами клеток, могут быть причиной недоброкачественной фильтрации.
Род Hanceniaspora (прежнее название Kloeckera apiculata)
Клетки мельче винных, имеют характерную лимоновидную (заостренную с обоих концов) форму, размеры (5-8) х (2-4) мкм. Размножаются в два раза быстрее, чем винные дрожжи рода Saccharomyces. Образуют псевдомицелий.
Размножаются биполярным почкованием. Некоторые штаммы могут сбродить сусло до объемной доли спирта 6-7 %. Продукты их метаболизма угнетают развитие культурных дрожжей, являясь причиной недоброда сусла и повышенного содержания летучих кислот и эфиров, придающих виноматериалам несвойственный им аромат яблочного вина. На сусло-агаре образуют серо-кремовые гладкие, блестящие колонии. Спор не образуют.
Род Hansenula
Клетки круглые, овальные, удлиненные, почкование многостороннее. Размеры (2-12) х (2-5) мкм. Встречается истинный мицелий и псевдомицелий. Образует споры шляповидные от 1 до 4 в клетке. На поверхности вина образует сухую матовую пленку, ползущую по стенкам, и со временем, оседающую на дно. Большинство штаммов развивается при содержании объемной доли спирта не больше 10 %.
На плотной среде колонии имеют белую ровную окраску, матовые. Эти дрожжи образуют большие количества этилацетата как в аэробных, так и в анаэробных условиях, придающего вину резкий, несвойственный ему аромат. Эффективная борьба с ними требует точного выполнения производственного режима при строгом соблюдении общих санитарно-технологических мероприятий на производстве.
Род Pichia
Клетки от круглых до сильно вытянутых. Размеры (4-10) х (2-5) мкм. Размножается многосторонним почкованием. Образует псевдомицелий. Споры круглые, шляповидные. Характерной особенностью является быстрое развитие на поверхности вина, с образованием толстой бело-желтой морщинистой пленки, в основном, за счет окисления спиртов и органических кислот. Кроме того, дрожжи Pichia активно разлагают глицерин, превращая его в молочную кислоту, Нитраты не ассимилируют. При развитии этих дрожжей в вине значительно изменяются его вкусовые количества и состав – увеличивается содержание летучих кислот, слабеет окраска, во вкусе появляются фруктово-эфирные и аптечные тона. Снижается бродильная способность винных дрожжей.
Род Saccharomyces
Виды, относящиеся к этому роду, не отличаются по морфологии. Клетки разнообразной формы: круглые, овальные, эллипсовидные или удлиненные. Размеры (10.5-18) х (3,5 – 10,5) мкм. Размножение почкованием. Споры круглые. Общей чертой является активное сбраживание сахаров и высокая спиртообразующая способность. Виды хорошо различаются по отношению к углеводам. Нитраты не усваиваются.
Обладая высокой активностью дыхания и брожения, хорошей способностью к размножению, они быстро становятся доминирующими в брожении сусла, придают вину характерный букет и вкус, определяют химический состав.
Род Saccharomycodes
Клетки крупные, подошвообразные, лимоновидные. Размеры (8-34) мкм в длину и до (4-9) мкм в диаметре. Размножаются биполярным почкующимся делением. Размножение начинается по типу почкования, а оканчивается по типу деления. Форма и размеры этих дрожжей очень характерны, поэтому их можно уверенно идентифицировать в вине путем микроскопирования.
Сбраживают и ассимилируют глюкозу, сахарозу и слабо – раффинозу; ассимилируют глицерин, этиловый спирт и молочную кислоту.
Отличаются высокой сульфитоустойчивостью, погибают лишь при массовой концентрации сернистого ангидрида в вине 850 мг/дм3. Образуют сложные эфиры, в основном этилацетат, причем в анаэробных условиях количество его удваивается, появляется неприятный кислый запах, свойственный этилацетату.
Род Zygosaccharomyces
Клетки круглые и овальные. Размеры от (2-8) х (2,5) мкм до (5-13) х (4,5-7) мкм. Размножаются многосторонним почкованием. Образуют аскоспоры (от 2 до 4 в сумке). Нитраты не ассимилируют. Общая биологическая особенность – способность развиваться в субстратах с высокими массовыми концентрациями сахара (до 800 г/дм3 ) – в вакуумсусле, бекмесе и вызывать их забраживание. В отличие от других родов дрожжей обладают высокой осмофильностью. Сбраживают фруктозу и глюкозу. Могут развиваться и вызывать забраживание вина с массовой концентрацией сахара от 20 до 50 г/дм3.
Род Schizosaccharomyces Lindner
Дрожжи, относящиеся к роду Schizosaccharomyces, имеют форму от шаровидной до цилиндрической, размножаются делением, могут образовывать разделенные перегородками гифы, артроспоры. Аскоспоры могут формироваться на начальной стадии роста. Споры в асках имееют шаровидную форму или представляют собой короткие эллипсоиды, редко цилиндрической формы. В процессе размножения значительное количество клеток овальной формы, встречаются и шаровидные. Клетки располагаются отдельно, парами, небольшими группами, образуют осадок пылевидной и хлопьевидной структур, иногда образуют на поверхности кольцо. Могут давать аски с 2-4 шаровидными или эллипсоидальными аскоспорами. Размеры клеток (25,0-5,0(5,0-2,5 мкм) сильно варьируют не только от штамма к штамму, но и внутри одной культуры.
Эти дрожжи развиваются не только за счет глюкозы и сахарозы, широко распространенных в природных субстратах, но и за счет осажденных крахмалистых субстратов – мальтозы и декстринов. Окислительная способность у дрожжей этого рода развита очень слабо. Они усваивают источники углеродистого питания главным образом в процессе брожения.


Бактерии
Уксуснокислые бактерии
Аэробные микроорганизмы, легко развивающиеся в виде пленки на поверхности вина при доступе воздуха. Легко дифференцировать по способу размножения при микроскопировании – наличие в центре перегородки. Форма клеток палочковидная, средние размеры (0,4-0,8) х (1,2-1,8) мкм. Обычно одиночные или в парах, иногда соединены в длинные цепочки. Подвижные формы наблюдаются только в молодой культуре (24-48 часов). Спор не образуют. Чувствительны к диоксиду серы, высокой кислотности и этанолу выше 12 % об. В неблагоприятных условиях образуют инволюционные формы – клетки-гиганты, в десятки раз больше обычных, шаровидные, колбовидные и нитевидные.
Окисляют этанол до уксусной кислоты и часть – до углекислого газа и воды. Способны к окислению других одноатомных спиртов, углеводов, органических кислот (винной, яблочной, молочной, янтарной, уксусной). Белые вина поражаются легче, чем красные; молодые легче, чем старые.
Развитию уксуснокислых бактерий способствует недоливка емкостей, негерметичность укупорки, высокая температура хранения.
Молочнокислые бактерии (МКБ)
Имеют форму палочек или кокков, размеры которых зависят от состава среды и условий культивирования. Палочковидные формы могут быть короткими, почти коккообразными, длиной 0,5-0,7 мкм и длинными, нитевидными, иногда достигающими длины 8,0 мкм. Располагаются они единично, парами или цепочками, некоторые с характерными обрубленными концами.
Кокковые формы молочнокислых бактерий бывают овальными, диаметр клеток от 0,5-0,6 до 1 мкм. Они располагаются единично, парами или цепочками различной длины, что характерно для рода Leuconostoc.
На форму клеток значительное влияние оказывает состав среды. Так, в средах с высоким содержанием этилового спирта, длина клеток молочнокислых бактерий увеличивается, этиловый спирт тормозит деление клеток сильнее, чем рост. Поэтому в спиртосодержащих средах палочки вытягиваются в длину, становятся тонкими; кокки сохраняют свою форму.
Молочнокислые бактерии, встречающиеся в виноделии, неподвижны, не образуют спор, положительно окрашиваются по Грамму, не образуют пигмент, не восстанавливают нитраты в нитриты; являются факультативными анаэробами, развиваются во всей толще среды,
отличаются высокой устойчивостью к спирту и высокой кислотности. Отдельные штаммы рода Leuconostoc развиваются в среде при рН 2,7-2,8 и этанола до 25% об.
Встречаются молочнокислые бактерии во всех типах вин и могут вызывать заболевание вина при сбраживании сахаров . Положительный процесс – снижение кислотности – яблочно-молочное брожение.
Процесс яблочно-молочного брожения требует обязательного контроля для установления его завершения, определяемого по исчезновению яблочной кислоты при хроматографическом определении органических кислот в виноматериале и по прекращению снижения титруемой кислотности, поскольку снижение кислотности, вызванное яблочно-молочным брожением, создает благоприятные условия для развития менее кислотовыносливых бактерий и утилизации ими других компонентов вина (пентоз, винной кислоты, глицерина),отрицательно влияющих на качество, часто определяемое как болезнь вина.

Читать фрагмент, купить и скачать в магазине электронных книг Купить  и  скачать  книгу Читать фрагмент, купить и скачать книгу fb2, epub, на андроид в магазине электронных книг ЛитРес

Читайте спиcок всех книг онлайн для бесплатного скачивания без регистрации: Рецепты домашних вин

Каталог книг по темам для бесплатного скачивания в электронных форматах

Наш сайт регулярно обновляется, и Вы можете получать новинки – электронные книги, которые на нём размещаются.
Подпишитесь на обзор книжек, и он будет приходить на Вашу электронную почту.
Вы всегда сможете легко отказаться от этой бесплатной рассылки. --> Читать последний выпуск книжной рассылки
подписаться на новые книги:
 
Я
Ищу
в возрасте от до

 
Следите за книжными новинками в Twitter
Рейтинг@Mail.ru Яндекс.Метрика +Freabooks